[發明專利]黃瓜果實苦味基因Bt緊密連鎖的SSR標記及其應用

有效

• 申請號: 201210185989.9
• 申請日: 2012-06-06
• 公開（公告）號: CN102690823A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 顧興芳;張圣平;苗晗;王燁
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;A01H1/04
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明涉及生物育種輔助技術，特別是一種黃瓜果實苦味基因Bt緊密連鎖的SSR標記及其應用。

背景技術

黃瓜（Cucumis?sativus?L.）生產中，特別是設施栽培過程中，有時會有苦味果實產生，導致收益損失（Rehm?et?al.，1957；顧興芳等，2000；Kano?et?al.，2002）。瓜類植物的苦味是由一類稱為葫蘆素(Cucurbitacins)的物質引起（Rice?et?al.，1981；Balkema?et?al.，2003）。葫蘆素屬于葫蘆烷型四環三萜化合物，對大多數生物體有毒（Smyth?et?al.，2002）。果實苦味是影響黃瓜生產的問題之一。荷蘭黃瓜育種家早在1959已經開始無苦味黃瓜的選育工作，并育成相應的品種，這些品種的營養器官和果實均無苦味（AndeweG?and?Bruyn，1959）。研究導致黃瓜果實苦味發生的基因的分子標記和遺傳定位，對于利用分子標記輔助選擇（Marker?Assisted?Selection，MAS）技術培育無苦味黃瓜具有重要意義。

已報道的控制黃瓜果實苦味的兩個基因是Bt和Bt-2（Barham，1953；Walters，2001）。本實驗室保存的黃瓜材料PI183967（基因型為BiBiBtBt）含有Bt基因。前人關于黃瓜果實苦味的研究多集中于遺傳規律、基因連鎖、環境影響、品種選育等方面。已有研究表明，Bt和Bt-2基因均符合單基因顯性遺傳，符合質量性狀遺傳的特點（Barham，1953；InGGamer?and?Deponti，1981；Walters?et?al.，2001）。Bt基因與黃瓜雌性基因F不存在連鎖（Cowen?and?Helsel，1983；顧興芳等，2005）。Bt-2基因與果色一致基因u、暗色果皮基因D、小刺基因ss連鎖（Wehner?and?Liu，1998；Walters?et?al.，2001）。栽培條件影響黃瓜苦味的發生（Kano?et?al.，2003），當土壤中的氮素過多或不足、有機肥缺乏、溫度過低或過高、日光照射不足、營養不良、上壤干旱缺水、病蟲害以及植株衰弱多病等條件下，都可誘發葫蘆素的形成和積累，從而形成苦味果實。

對于黃瓜果實苦味決定基因Bt分子水平的研究主要是由本實驗室開展進行的。我們從分子水平對果實苦味基因進行了研究并獲得了與Bt基因連鎖的兩個顯性AFLP標記：E23M66-101和E25M65-213。這兩個標記與Bt基因的遺傳距離分別為5cM和4cM，并且位于Bt基因的兩側（顧興芳等，2006）。2011年以果實無苦味的黃瓜純合自交系新泰密刺（btbt）和果實有苦味46GBt（BtBt）為親本構建的含有184個單株的F₂群體為試材，對其進行SSR標記遺傳連鎖分析，構建了Bt基因的SSR連鎖群。與Bt基因最近的兩側標記為SSR10795和SSR07081，遺傳距離分別為0.8cM和2.5cM（張圣平等，2011）。但是上述標記還存在連鎖距離相對較遠，且標記的檢測準確率相對較低的問題，在進行無苦味黃瓜育種篩選中的選擇效率相對較低。

黃瓜果實苦味的遺傳比較復雜，受到營養體苦味基因Bi的影響，隱性bi基因與Bt基因存在互作效應（Gu?et?al.，2007）。但在純合Bi基因背景下，Bt基因是獨立遺傳的（Barham，1953；Walters?and?Wehner，1998；Gu?et?al.，2007）。為了排除黃瓜營養體苦味基因對果實苦味基因的互作影響，本發明中利用營養體苦味基因純合的基因型，進行了果實苦味Bt基因的SSR分子標記及遺傳定位研究。

目前檢測黃瓜苦味的方法多為感觀品嘗和化學檢測，化學檢測雖可檢測大批材料但較為繁瑣，其結果也不夠準確；感觀品嘗僅適于少量材料的檢測，并且無法進行精確定級（顧興芳等，2004），所以急需建立一套快速準確鑒定苦味的方法，為培育無苦味黃瓜提供理論依據。分子標記輔助選擇(MAS)技術通過找到與苦味基因緊密連鎖的分子標記可在苗期或直接用種子進行鑒定，簡工節本，大大縮短育種進程。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術不足，提供了與黃瓜果實苦味基因Bt緊密連鎖的SSR標記，并提供了其在選擇無苦味黃瓜種質資源上的應用，采用本發明獲得的SSR標記，可以在黃瓜候選材料的任何階段對其進行果實苦味或果實無苦味的篩選，具有高效、限制少、準確的優點，為黃瓜育種選擇無苦味材料提高了選擇效率和準確性。

黃瓜果實苦味基因Bt緊密連鎖的SSR標記，序列如下：