[發(fā)明專利]一種重組人表皮生長因子的新型制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210181522.7
• 申請日: 2012-06-05
• 公開（公告）號(hào): CN102757974A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬一;張?jiān)戮?/a>;張琨;王琰;訾靜;張志敏;王軍
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西省微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C12N15/70;C07K14/485;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種Ssp內(nèi)含肽系統(tǒng)介導(dǎo)的重組人表皮細(xì)胞生長因子的新型制備方法。

背景技術(shù)

人表皮生長因子(human?epidermal?growth?factor，hEGF)是由53個(gè)氨基酸組成的的小分子多肽，分子量6.2KD左右，等電點(diǎn)4.2-4.6，對熱穩(wěn)定，耐胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的消化。該分子中含有六個(gè)半胱氨酸，在半胱氨酸6-20、14-31、33-42之間形成三個(gè)二硫鍵，從而分別形成三個(gè)環(huán)，這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)使得hEGF對蛋白酶具有較高的穩(wěn)定性。

人表皮生長因子是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞分裂促進(jìn)因子，它能夠刺激表皮、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管生長，因此用于可用于治療皮膚燒傷、外科傷口的愈合，以及外傷性角膜潰瘍、角膜損傷、化學(xué)試劑灼傷角膜以及角膜移植；hEGF能夠抑制胃酸分泌，增加細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成量，促進(jìn)胃腸上皮細(xì)胞生長，從而促進(jìn)胃潰瘍、十二指腸潰瘍愈合。

hEGF在化妝品中具有促進(jìn)皮膚組織細(xì)胞增殖與生長，使新生年輕細(xì)胞迅速代替衰老或死亡細(xì)胞，從而降低構(gòu)成細(xì)胞的平均年齡，達(dá)到美白、抗衰老和增加皮膚彈性和光澤的作用，因此作為化妝品原料添加于化妝品中對肌膚有修復(fù)、調(diào)養(yǎng)、祛痘等功能。hEGF作為添加劑還可以添加到牙齒護(hù)理劑、牙膏、洗發(fā)水以及飼料添加劑中。

目前hEGF生產(chǎn)有三種方法，①化學(xué)合成：1988年Marchi等人首先完成了EGF的全合成，由于hEGF分子中二硫鍵及其他多種官能團(tuán)的存在，因而合成的產(chǎn)物純度及產(chǎn)率都無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求；②生物來源提取：主要從人尿液中分離回收，天然來源中hEGF濃度低，一般小于1ug/L左右，因而分離提純效率低；③基因工程技術(shù)：hEGF的生產(chǎn)目前重點(diǎn)在基因工程技術(shù)的研究。

利用基因工程方法獨(dú)立表達(dá)hEGF非常困難，因?yàn)閔EGF是小分子多肽，分子量僅為6.2KD左右，且含有3對二硫鍵，在細(xì)菌胞質(zhì)中很難單獨(dú)形成包涵體，表達(dá)產(chǎn)物在胞內(nèi)的堆積會(huì)造成蛋白酶的攻擊而發(fā)生降解。目前多采用分泌表達(dá)載體或融合表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)hEGF在細(xì)胞中的高水平表達(dá)。分泌表達(dá)載體表達(dá)的發(fā)酵液中hEGF初始濃度較高，但是發(fā)酵后獲得的發(fā)酵液體系大，純化工藝復(fù)雜，通常需要3-6步層析操作才能夠獲得純度較高的rhEGF，收率僅為20％左右；胞內(nèi)融合表達(dá)rhEGF是在目的蛋白之前或之后加入特定的親和標(biāo)簽，如His、Gst等，形成融合蛋白，這些親和標(biāo)簽?zāi)軌蛲ㄟ^親和層析獲得純化的融合蛋白。由于融合蛋白中含有親和標(biāo)簽，所以需要蛋白酶將親和標(biāo)簽從融合蛋白中移除下來，從而獲得純化的目的蛋白。但是所需要的蛋白酶不僅價(jià)格昂貴，而且?guī)砹肆硗獾膯栴}：①需要將目的蛋白從親和標(biāo)簽、融合蛋白以及蛋白酶中分離出來，增加了純化的步驟，降低了目的蛋白的收率；②目的蛋白上可能存在蛋白酶的敏感位點(diǎn)，造成錯(cuò)誤切割，降低得率。

采用自切割內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白表達(dá)純化方法可以克服以上缺陷。已有商品化的自切割親和純化系統(tǒng)主要有New?England?Biolabs(NEB)公司的IMPACT、IMPACT-CN及IMPACT-TWIN等系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的pTWIN1、pTWIN2等表達(dá)載體首先將編碼親和標(biāo)簽、內(nèi)含肽以及目標(biāo)蛋白的基因序列連接在一起，在合適的宿主系統(tǒng)中表達(dá)出一個(gè)標(biāo)簽-內(nèi)含肽-目標(biāo)蛋白的三聯(lián)體，再采用幾丁質(zhì)親和純化及柱上切割的方式在某些理化因素作用下(如pH、溫度的變化或者巰基化合物的加入)，在親和層析柱上發(fā)生自切割純化出目標(biāo)蛋白。Roman?S.Esipov等人利用幾丁質(zhì)親和層析純化對rhEGF進(jìn)行純化，1L發(fā)酵培養(yǎng)基中可純化獲得17mg目的蛋白(Productiom?of?recombinant?human?epidermal?growth?factor?using?Ssp?dnaB?mini-intein?system，2008，61：1-6.)。該純化方法采用的幾丁質(zhì)珠填料價(jià)格高昂，100ml填料2790元，且該填料僅能重復(fù)使用3-5次，對擴(kuò)大化生產(chǎn)應(yīng)用是一個(gè)很大的限制。另外，柱上切割會(huì)導(dǎo)致目的蛋白的損失，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用NEB公司的pTWIN1和pTWIN2載體表達(dá)蛋白的過程中，目的蛋白與內(nèi)含肽之間存在自動(dòng)裂解或不能控制性的裂解，柱上切割之前就有目的蛋白的損失，從而導(dǎo)致獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)量較低。因此，找到替代幾丁質(zhì)珠親和層析和柱上切割法純化內(nèi)含肽介導(dǎo)的重組人表皮生長因子是Ssp內(nèi)含肽介導(dǎo)的純化技術(shù)能否擴(kuò)大化生產(chǎn)重組人表皮生長因子的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容