[發明專利]一種重組人表皮生長因子的新型制備方法有效
| 申請號： | 201210181522.7 | 申請日： | 2012-06-05 |
| 公開（公告）號： | CN102757974A | 公開（公告）日： | 2012-10-31 |
| 發明（設計）人： | 萬一;張月娟;張琨;王琰;訾靜;張志敏;王軍 | 申請（專利權）人： | 陜西省微生物研究所 |
| 主分類號： | C12N15/62 | 分類號： | C12N15/62;C12N15/70;C07K14/485;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18 |
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| 地址： | 710043*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 重組 表皮 生長因子 新型 制備 方法 | ||
1.一種重組人表皮生長因子的新型制備方法，其特征在于：按照以下步驟依次進行：
1)將hEGF與內含肽、幾丁質結合域融合表達，表達載體為pTWIN1或pTWIN2，宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)或ER2566；
2)將表達融合蛋白的宿主細胞破碎后，離心獲得沉淀，融合蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，包涵體經洗滌、溶解、復性后，通過液相切割誘導內含肽自切割位點釋放hEGF蛋白，再通過硫酸銨分級沉淀、離子交換層析純化獲得純度大于97％的不含有多余氨基酸的hEGF蛋白。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述權利要求1步驟1)中hEGF、內含肽和幾丁質結合域融合表達的連接順序為幾丁質結合域-內含肽-hEGF。
3.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于：
所述權利要求1步驟2)中的重組人表皮生長因子的切割方法為具有自切割功能的內含肽的自切割。
4.如權利要求3所述的重組人表皮生長因子的制備方法，其特征在于：所述的具有自切割功能的內含肽為Ssp?DnaB。
5.如權利要求1所述的重組人表皮生長因子的制備方法，其特征在于：所述權利要求1步驟2)中的重組人表皮生長因子的切割方法為液相切割，即通過降低復性緩沖液pH值，室溫誘導Ssp?DnaB內含肽自切割，釋放出hEGF。
6.如權利要求5所述復性緩沖液初始pH值為8.0-10.0；降低后的復性緩沖液pH值為6.0-7.0。
7.如權利要求1所述的重組人表皮生長因子的制備方法，其特征在于：所述權利要求1步驟2)中硫酸銨分級沉淀的純化方法為10％-40％硫酸銨溶液除?去雜蛋白，60％-80％硫酸銨溶液沉淀hEGF。
8.如權利要求1所述的重組人表皮生長因子的制備方法，其特征在于：所述權利要求1步驟2)中的重組人表皮生長因子的純化方法為陰離子交換層析，優選DEAE瓊脂糖陰離子交換層析。?
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