[發(fā)明專利]無選擇標記殘留的乳酸菌基因組基因操作系統(tǒng)及其應用

有效

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• 申請日: 2012-06-04
• 公開（公告）號: CN102732502A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設計）人: 李一經;崔紅玉;葛俊偉
• 申請（專利權）人: 東北農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/225
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發(fā)明涉及一種基因操作系統(tǒng)及其應用，特別涉及一種新型的無選擇標記殘留的乳酸菌基因組基因操作系統(tǒng)及其應用。屬于生物技術領域。

背景技術

乳酸菌作為人和動物腸道主要的益生菌群之一，在食品和發(fā)酵工業(yè)中的長期應用早已證明其安全級特性，其具有許多健康功效，乳酸菌能非特異性提高人和動物的免疫力，特別是在提高人和動物的胃腸道粘膜免疫功能方面，乳酸菌產生的乳酸菌素、細菌素、乳酸和其它多種有機酸類均具有抑菌、抗腹瀉作用，在調節(jié)腸道菌群失調，增強腸道粘膜免疫功能，預防腸道傳染性疾病中發(fā)揮重要作用；乳酸菌本身對黏膜有良好的黏附和腸道定植功能，并且乳酸菌細胞壁的胞壁酰二肽亦具有免疫佐劑作用等。乳酸菌的這些益生特點，使其作為良好的表達外源抗原的動物生態(tài)活載體在探索特異性抗原傳遞和誘導黏膜免疫應答方面有其獨特的優(yōu)勢和潛在的應用價值。

通過乳酸菌攜帶的質粒插入外源基因轉化乳酸菌作為抗原傳遞系統(tǒng)進行人和動物的粘膜免疫已在某些方面取得了可喜進展，許多研究揭示了乳酸菌質粒傳遞系統(tǒng)可表達外源抗原并能誘導特異性的局部黏膜和系統(tǒng)免疫應答，為利用乳酸菌的益生功能和特異性的疾病預防奠定了重要的理論和實踐基礎。

但利用質粒系統(tǒng)進行外源抗原的表達存在很多缺陷，如乳酸菌質粒表達系統(tǒng)對外源抗原的表達量明顯低于大腸桿菌表達系統(tǒng)；質粒表達存在不穩(wěn)定性；質粒在細菌增殖過程中可發(fā)生丟失現象；質粒在細菌間的傳遞尤其是質粒中存在抗性基因使乳酸菌作為人和動物疫苗存在著重大生物安全隱患。因此，如何實現乳酸菌對外源基因的穩(wěn)定、高效表達以及重組乳酸菌絕對不能攜帶有包括抗性基因在內的任何選擇標記和多余堿基，完全符合生物制品生物安全評價標準，又能達到真正意義上的食品安全級乳酸菌活載體標準的要求，并能有效遞呈目的抗原、增強抗原特異性的黏膜免疫應答，是當前需要進一步攻克的基礎科學問題，顯然乳酸菌的基因組的插入和缺失操作，尤其是無任何選擇標記殘留的乳酸菌基因組修飾操作系統(tǒng)就具有十分重大的現實意義。

隨著現代生物技術的巨大進步，已發(fā)展了多種基因操作技術在乳酸菌染色體水平上進行基因的缺失和插入操作。隨著乳酸菌分子遺傳學理論研究的深入，多種益生性乳酸菌的全基因組序列的測定、乳酸菌相關基因的結構與功能有了清晰的認識，為進一步實現乳酸菌染色體基因敲除和外源基因的插入及其穩(wěn)定表達奠定了基礎。

發(fā)明內容

針對現有技術中存在的問題，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供了一種新型無任何選擇標記殘留的乳酸菌基因組修飾操作系統(tǒng)，其特征在于包括一個輔助質粒、一個用于構建基因打靶主質粒的中間質粒和一個作為基因操作基礎的乳酸菌菌株；

其中所述輔助質粒含有一個寬宿主范圍穿梭型紅霉素抗性基因和一個溫度敏感型及寬宿主范圍穿梭型完整的pWV01復制子；

其中所述用于構建基因打靶主質粒的中間質粒含有一個寬宿主范圍穿梭型氯霉素抗性基因、一個溫度敏感型及寬宿主范圍穿梭型完整pWV01復制子和一個表達尿嘧啶磷酸核糖轉移酶（uracil?phosphoribosyl?transferase,UPP）基因的寬宿主范圍穿梭型表達盒；

其中所述的基因操作基礎乳酸菌菌株為缺失尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因（upp）的任意乳酸菌菌株。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述輔助質粒依次含有大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍表達的穿梭型紅霉素抗性基因Emr、溫度敏感型及大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型完整的pWV01復制子。

本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述用于構建基因打靶主質粒的中間質粒依次含有大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍表達的穿梭型氯霉素抗性基因Cmr、一個溫度敏感型及大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型完整pWV01復制子、一個表達尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因的寬宿主范圍表達盒p32upp。

本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的乳酸菌菌株為缺失upp基因的完整開放閱讀框，但保留了upp基因的原始啟動子和終止子的乳酸菌菌株。