[發明專利]無選擇標記殘留的乳酸菌基因組基因操作系統及其應用

有效

• 申請號: 201210180721.6
• 申請日: 2012-06-04
• 公開（公告）號: CN102732502A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 李一經;崔紅玉;葛俊偉
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/225
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

1.一種無選擇標記殘留的乳酸菌基因組修飾操作系統，其特征在于包括一個輔助質粒、一個用于構建基因打靶主質粒的中間質粒和一個作為基因操作基礎的乳酸菌菌株，

其中所述輔助質粒含有一個寬宿主范圍穿梭型紅霉素抗性基因和一個溫度敏感型及寬宿主范圍穿梭型完整的pWV01復制子；

其中所述用于構建基因打靶主質粒的中間質粒含有一個寬宿主范圍穿梭型氯霉素抗性基因、一個溫度敏感型及寬宿主范圍穿梭型完整的pWV01復制子和一個表達尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因（upp）的寬宿主范圍穿梭型表達盒；

其中所述的乳酸菌菌株為缺失尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因的任意乳酸菌菌株。

2.如權利要求1所述的無選擇標記殘留的乳酸菌基因組修飾操作系統，其特征在于所述輔助質粒依次含有大腸桿菌—革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍表達的穿梭型紅霉素抗性基因Emr、溫度敏感型及大腸桿菌—革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型完整的pWV01復制子。

3.如權利要求1所述的無選擇標記殘留的乳酸菌基因組修飾操作系統，其特征在于所述用于構建基因打靶主質粒的中間質粒依次含有大腸桿菌—革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍表達的穿梭型氯霉素抗性基因Cmr、一個溫度敏感型及大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型完整pWV01復制子、一個表達尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因的寬宿主范圍表達盒p32upp。

4.如權利要求1所述的無選擇標記殘留的乳酸菌基因組修飾操作系統，其特征在于所述的乳酸菌菌株為缺失尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因的完整開放閱讀框，但保留了upp基因的原始啟動子和終止子的乳酸菌菌株。

5.如權利要求2所述的無選擇標記殘留的乳酸菌基因組修飾操作系統，其特征在于所述的輔助質粒中，大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型紅霉素抗性基因Emr依次由ermC啟動子、ermC基因、ermC終止子構成，優選的所述的大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型紅霉素抗性基因Emr為962bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；溫度敏感型及大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型完整的pWV01復制子依次由單鏈復制起始位點、雙鏈復制起始位點、ORF?B基因、ORF?C基因、RepA基因、ORF?D基因構成，優選的所述的溫度敏感型及大腸桿菌-革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型完整的pWV01復制子為1751bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

6.如權利要求5所述的無選擇標記殘留的乳酸菌基因組修飾操作系統，其特征在于所述的輔助質粒為pGBHE，其完整核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。

7.如權利要求3所述的無選擇標記殘留的乳酸菌基因組修飾操作系統，其特征在于在所述的中間質粒中，大腸桿菌—革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型氯霉素抗性基因Cmr依次由ermC啟動子、Cmr基因、ermC終止子構成，優選的所述的大腸桿菌—革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型氯霉素抗性基因Cmr為896bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；溫度敏感型及大腸桿菌—革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型完整的pWV01復制子依次由單鏈復制起始位點、雙鏈復制起始位點、ORFB基因、ORF?C基因、RepA基因、ORF?D基因構成，優選的所述的溫度敏感型及大腸桿菌—革蘭氏陽性細菌寬宿主范圍穿梭型完整的pWV01復制子為1751bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；表達尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因的寬宿主范圍p32upp表達盒，依次由p32-啟動子、upp基因、prt-終止子構成，在p32upp表達盒的上游依次含有三個乳酸菌的極稀有限制性內切酶位點Asc?Ⅰ（GGCGCGCC）、Pac?Ⅰ（TTAATTAA）、Not?Ⅰ（GCGGCCGC），優選的所述的p32upp表達盒為1086bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

8.如權利要求7所述的無選擇標記殘留的乳酸菌基因組修飾操作系統，其特征在于在所述的中間質粒為pGBHC32upp，該質粒的完整核苷酸序列如SEQ?IDNO.7所示。