[發明專利]一種泰樂菌素基因工程菌及其應用

無效

• 申請號: 201210179669.2
• 申請日: 2012-06-04
• 公開（公告）號: CN102690775A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 王義;任勇;劉建成;王文超;徐淑芬
• 申請（專利權）人: 寧夏泰瑞制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/76;C12P19/62;C12R1/54
• 代理公司: 寧夏專利服務中心 64100
• 代理人: 葉學軍

技術領域

本發明屬于基因工程和生物發酵工業技術領域，具體涉及一種泰樂菌素基因工程菌及其應用。

背景技術

泰樂菌素是由弗氏鏈霉菌(Streptomyces?fradiae)、龜裂鏈霉菌(Streptomyces?romosus)和吸水鏈霉菌(Streptomyces?hygroscopicus)次級代謝產生的一種大環內酯類抗生素，其中弗氏鏈霉菌是泰樂菌素的主要產生菌。泰樂菌素主要由泰樂菌素A、脫碳霉糖泰樂菌素(desmycosin)B、大菌素(macrocin)C和雷洛菌素(relomycin)D?4種組分構成，其中泰樂菌素A為主要成分，且生物活性最高。

泰樂菌素A的主體結構為含有16個原子所形成的環狀內酯即：泰樂內酯(Tylactone)，然后依次連上三個脫氧糖苷配基，三個脫氧糖苷配基的連接順序為：碳霉氨基糖(Mycaminose)，5′-脫氧-D-阿洛糖(Mycinose)，碳霉糖(Mycarose)見圖1。

泰樂菌素是國家三類新獸藥，具有廣譜抗菌性，除對支原體有特效外，對葡萄球菌、鏈球菌、棒狀桿菌、分支桿菌、巴氏桿菌、螺旋體等也有較強作用，同時它對球蟲病也有一定作用。是畜禽專用抗生素，不會給人類帶來交叉耐藥性問題。

在當前和今后一段相當長的時間內，作為禽畜專用抗生素泰樂菌素將不僅是禽畜養殖業用于治療禽畜支原體病的理想藥物，而且仍將是廣受歡迎的飼料添加劑。盡管目前國內已經有泰樂菌素的規模生產，但是菌種產素能力偏低，菌種發酵水平為11000～12000u/ml，泰樂菌素A組份含量為80％～85％。菌種選育仍處在傳統的選育水平，泰樂菌素產量有待于進一步的提高。而且在生產過程中C組份不容易向A組份轉化，導致泰樂菌素A組份含量偏低，泰樂菌素產品不符合獸藥藥典標準，生產成本較高。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術缺陷，采用獨特方法，提供了一種泰樂菌素基因工程菌；

本發明的另一目的是提供一種將上述工程菌應用于泰樂菌素生產的方法。

本發明是通過如下技術方案實現的：

一種泰樂菌素基因工程菌，其構建方法為：通過PCR克隆泰樂菌素合成關鍵限速酶基因TylF及透明顫菌血紅蛋白VHb基因，利用大腸桿菌-鏈霉菌穿梭表達載體構建重組質粒，將重組質粒導入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，將大腸桿菌ET12567/pUZ8002與弗氏鏈霉菌孢子進行結合轉移培養，轉化鏈霉菌，然后通過安普霉素抗性篩選轉化子，用PCR進一步確定轉化子，最終獲得基因工程菌；

所述的工程菌的具體構建步驟為：

(1)設計PCR引物，擴增TylF基因和血紅蛋白基因VHb；

(2)分別將克隆得到的目的基因插入pFC119組成型強啟動子ermE^*下游多克隆位點；

(3)將篩選獲得的重組質粒轉化大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，用以結合轉移；

(4)將還有重組子的大腸桿菌ET12567/pUZ8002與弗氏鏈霉菌孢子進行熱激培養，然后用合適濃度的安普霉素和萘啶酮酸篩選轉化子；

(5)對轉化子進行PCR鑒定，獲得基因工程菌。

一種泰樂菌素基因工程菌的應用方法，其步驟為：

(1)在室溫下刮取弗氏鏈霉菌Strepyomyce?fradiae基因工程菌的斜面孢子；

(2)將斜面孢子接種到裝有100ml種子培養基的500ml三角瓶中，29℃，230rpm搖床中培養48小時，制備成種子液；

(3)在上述種子液中以重量10％的接種量將泰樂菌素基因工程菌接種到30L自動發酵罐中，29℃培養，培養周期144h；

(4)通過分光光度計和HPLC來檢測泰樂菌素效價及泰樂菌素A組份百分含量；

所述培養基組成及質量含量為：

種子培養基組成為：豆餅粉0.5％，酵母膏0.5％，玉米漿0.3％，CaCO₃0.3％，豆油0.56％，其余為水，PH為7.8～8.0；

發酵培養基組成為：豆餅粉0.5％，魚粉0.97％，玉米蛋白粉0.97％，玉米粉1.77％，氯化鉀0.1％，氯化鈉0.1％，鹽酸甜菜堿0.05％，0.33％CoCl₂?0.1％，0.44％NiSO₄?0.1％，CaCO₃?0.2％，豆油5％，其余為水。

本發明的泰樂菌素基因工程菌為弗氏鏈霉菌(Strepyomyce?fradiae)TL-209，保藏于申請人菌研所菌種保藏室。