[發明專利]一種泰樂菌素基因工程菌及其應用

無效

• 申請號: 201210179669.2
• 申請日: 2012-06-04
• 公開（公告）號: CN102690775A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 王義;任勇;劉建成;王文超;徐淑芬
• 申請（專利權）人: 寧夏泰瑞制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/76;C12P19/62;C12R1/54
• 代理公司: 寧夏專利服務中心 64100
• 代理人: 葉學軍

1.一種泰樂菌素基因工程菌，其構建方法為：通過PCR克隆泰樂菌素合成關鍵限速酶基因TylF及透明顫菌血紅蛋白VHb基因，利用大腸桿菌-鏈霉菌穿梭表達載體構建重組質粒，將重組質粒導入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，將大腸桿菌ET12567/pUZ8002與弗氏鏈霉菌孢子進行結合轉移培養，轉化鏈霉菌，然后通過安普霉素抗性篩選轉化子，用PCR進一步確定轉化子，最終獲得基因工程菌。

2.如權利要求1所述的工程菌，其特征在于其具體構建步驟為：

(1)設計PCR引物，擴增TylF基因和血紅蛋白基因VHb；

(2)分別將克隆得到的目的基因插入pFC119組成型強啟動子ermE^*下游多克隆位點；

(3)將篩選獲得的重組質粒轉化大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，用以結合轉移；

(4)將還有重組子的大腸桿菌ET12567/pUZ8002與弗氏鏈霉菌孢子進行熱激培養，然后用合適濃度的安普霉素和萘啶酮酸篩選轉化子；

(5)對轉化子進行PCR鑒定，獲得基因工程菌。

3.一種泰樂菌素基因工程菌的應用方法，其步驟為：

(1)在室溫下刮取弗氏鏈霉菌Strepyomyce?fradiae基因工程菌的斜面孢子；

(2)將斜面孢子接種到裝有100ml種子培養基的500ml三角瓶中，29℃，230rpm搖床中培養48小時，制備成種子液；

(3)在上述種子液中以重量10％的接種量將泰樂菌素基因工程菌接種到30L自動發酵罐中，29℃培養，培養周期144h；

(4)通過分光光度計和HPLC來檢測泰樂菌素效價及泰樂菌素A組份百分含量。

4.如權利要求3所述的應用方法，其特征在于所述培養基組成及質量含量為：

種子培養基組成為：豆餅粉0.5％，酵母膏0.5％，玉米漿0.3％，CaCO₃?0.3％，豆油0.56％，其余為水，PH為7.8～8.0；

發酵培養基組成為：豆餅粉0.5％，魚粉0.97％，玉米蛋白粉0.97％，玉米粉1.77％，氯化鉀0.1％，氯化鈉0.1％，鹽酸甜菜堿0.05％，0.33％CoCl₂?0.1％，0.44％NiSO₄?0.1％，CaCO₃?0.2％，豆油5％，其余為水。