[發明專利]溶血性鏈球菌檢測用引物組及方法

無效

• 申請號: 201210179196.6
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN102747149A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 王小玉;馮家望;唐食明;胡松楠;游淑珠;鄺筱珊
• 申請（專利權）人: 王小玉;馮家望;唐食明
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/46
• 代理公司: 廣東秉德律師事務所 44291
• 代理人: 楊煥軍;田學東

1.一種溶血性鏈球菌檢測用引物組，其特征在于，包括下列引物：

F3引物：CTC?ACA?ATC?GTC?TTA?GTA；

B3引物：CAT?AAC?ACA?CTG?GGT?TCT?TGA?AT；

FIP引物：

CTC?TAT?GAA?TCG?CCG?GTC?TAG?ATG?TAG?ACT?GCT?CAT?GTT?GTT?AGC?CTG；

BIP引物：

CTT?CGT?GCA?TGA?TAG?GTG?GAC?GTG?AAT?CGG?GTC?AAT?CCT?ATA?GC。

2.一種溶血性鏈球菌的檢測方法，其特征在于，具體為：

（101）對待檢樣品提取待檢模板DNA

待檢樣品用增菌液進行培養，得待檢增菌液，取1mL待檢增菌液，7000×g離心2min，吸棄上清液；加入80μL?DNA提取液，混勻后沸水浴10min，置冰上10min；7000×g離心2min，取上清液作為待檢模板DNA；

（102）溶血性鏈球菌的環介導等溫擴增

按下述LAMP反應體系，在反應管中加入相應的引物、dNTPs、ThermoPol緩沖液、MgSO₄、Bst?DNA聚合酶、水，混勻，然后加入甜菜堿，最后在反應管中加入待檢模板DNA，進行65℃環介導等溫擴增反應60min；

LAMP反應體系為：

??組分??反應體系終濃度??F3引物??0.2μmol/L??B3引物??0.2μmol/L??FIP引物??1.6μmol/L??BIP引物??1.6μmol/L??dNTPs??1.6mmol/L??甜菜堿??0.8mol/L

??MgSO₄??8mmol/L??ThermoPol緩沖液??1×??Bst?DNA聚合酶??0.16U/μL??待檢模板DNA??/??去離子水??/

（103）設置空白對照、陰性對照、陽性對照

（131）空白對照：以水替代待檢模板DNA另外操作步驟（102）；

（132）陰性對照：以DNA提取液替代待檢模板DNA另外操作步驟（102）；

（133）陽性對照：以溶血性鏈球菌標準菌株模板DNA替代待檢模板DNA另外操作步驟（102）；

（104）檢測結果判定

（141）在各反應管中分別加入2μL顯色液，輕輕混勻并在黑色背景下觀察；

（142）在空白對照和陰性對照反應管液體為橙色，陽性對照反應管液體呈綠色的條件下：待檢模板DNA反應管液體呈綠色，該待檢樣品結果為溶血性鏈球菌初篩陽性；待檢模板DNA反應管液體呈橙色，該待檢樣品結果為溶血性鏈球菌陰性。

（143）若與上述條件不符，則本次檢測結果無效，重新檢測。