[發明專利]溶血性鏈球菌檢測用引物組及方法

無效

• 申請號: 201210179196.6
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN102747149A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 王小玉;馮家望;唐食明;胡松楠;游淑珠;鄺筱珊
• 申請（專利權）人: 王小玉;馮家望;唐食明
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/46
• 代理公司: 廣東秉德律師事務所 44291
• 代理人: 楊煥軍;田學東

【技術領域】

本發明屬于食品安全領域，涉及環介導等溫擴增技術，具體涉及一種溶血性鏈球菌檢測用引物組及方法。?

【背景技術】

溶血性鏈球菌在自然界中分布較廣，存在于水、空氣、塵埃、糞便及健康人和動物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通過直接接觸、空氣飛沫傳播或通過皮膚、粘膜傷口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也會對人類進行感染。（1）α-溶血性鏈球菌：菌落周圍有1-2mm寬的草綠色溶血環，也稱甲型溶血，這類鏈球菌多為條件致病菌。（2）β-溶血性鏈球菌：菌落周圍形成一個2-4mm寬、界限分明、完全透明的無色溶血環，也稱乙型溶血，因而這類菌亦稱為溶血性鏈球菌，該菌的致病力強，常引起人類和動物的多種疾病。溶血性鏈球菌?？梢鹌つw、皮下組織的化膿性炎癥、呼吸道感染、流行性咽炎的爆發性流行以及新生兒敗血癥、細菌性心內膜炎、猩紅熱和風濕熱、腎小球腎炎等變態反應。溶血性鏈球菌的致病性與其產生的毒素及其侵襲性酶有關。上呼吸道感染患者、人畜化膿性感染部位常成為食品污染的污染源。一般來說，溶血性鏈球菌常通過以下途徑污染食品：1、食品加工或銷售人員口腔、鼻腔、手、面部有化膿性炎癥時造成食品的污染；2、食品在加工前就已帶菌、奶?；蓟撔匀橄傺谆蛐笄菥植炕摃r，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包裝不善而使食品受到污染。?

雖然傳統溶血性鏈球菌檢測方法是可靠的，但卻很費力、耗時，需要4～7天才能完成。由于其檢測周期長、程序復雜、所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現代檢測要求。因此，在需要及時、快速評價食品中微生物的安全性時，?通常不被采用。隨著現代科學技術的不斷發展，特別是免疫學、生物化學、分子生物學的不斷發展，人們已創建了不少快速、簡便、特異、敏感且適用的溶血性鏈球菌檢測方法，其中許多可以在48h內檢出溶血性鏈球菌，這些方法通稱為快速檢測。?

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated?Isothermal?Amplification，LAMP）是日本的榮研株式會的Notomi?T等2000年在Nucleic.Acids.Res.雜志上報道的一種新的核酸擴增方法。LAMP方法是針對靶基因的6個區域設計4種特異的引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件保溫幾十分鐘，完成核酸擴增反應?？梢栽?小時之內，將靶基因DNA片段擴增109-1010倍，并且只要用肉眼觀察白色混濁沉淀，就能鑒定是否擴增，不需要電泳檢測過程。?

LAMP方法的原理決定了它具有許多其它DNA擴增方法無法比擬的優點：（1）操作簡單，無需特殊設備。LAMP反應在等溫狀態下就能進行，無需預先進行雙鏈的變性。同時LAMP反應不需要特殊儀器和試劑，只需要將PCR反應中的Taq?DNA聚合換成具有鏈置換活性的Bst?DNA聚合酶。（2）靈敏度高。LAMP方法能檢測到比PCR方法還少的拷貝數，其靈敏度可以比PCR法高10～100倍。（3）特異性強。LAMP應體系要求四條引物完全匹配才能進行擴增，信息量大，因此反應體系中的其他模板對反應的干擾很小。（4）速度快，耗時短。LAMP反應不需要加熱變性，省去了熱循環步驟，40～60min即完成擴增反應。（5）可直接擴增RNA。擴增RNA時，只要在擴增DNA試劑的基礎上加上逆轉錄酶和酶阻抑劑，就能一步實現RNA的擴增?？茖W家們已經建立了逆轉錄LAMP（RT-LAMP）方，該方法的靈敏度是RT-PCR方法的100倍。（6）產物檢測方便、快捷。LAMP反應只要用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度就能夠判斷擴增與否，進行實時驗證。?

【發明內容】

本發明要解決的一個技術問題是，提供一種對溶血性鏈球菌具有特異性的引物組。

上述技術問題通過以下技術方案實現：?

一種溶血性鏈球菌檢測用引物組，其特征在于，包括下列引物：?

F3引物：CAGTCAATCCTCGGTCAG；?

B3引物：GATTTCACATAAGGATGTGTCTA；?

FIP引物：?

CAGTATGTATGGCAGGTATCGAAGTAAACAGGTCTTGATGTTAGCCTG；?

BIP引物：?

GCGTGGGCTTGATAGGTGGACGTTTATACGGTCCTTCGTAAAGC。?

本發明要解決的另一個技術問題是，提供一種利用上述引物組基于環介導等溫擴增法檢測溶血性鏈球菌的方法。?

上述技術問題通過以下技術方案實現：?

一種溶血性鏈球菌的檢測方法，具體為：?

（101）對待檢樣品提取待檢模板DNA?