[發明專利]具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體及其構建方法

無效

• 申請號: 201210178980.5
• 申請日: 2012-06-01
• 公開（公告）號: CN103451217A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 董亢;陳文柱;徐士軍;盧圣東;王珠銀
• 申請（專利權）人: 南京金斯瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 夏平;傅婷婷

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體及其構建方法。

背景技術

基因重組是分子生物學常用的研究手段，其中不可避免的要用到質粒載體。質粒是小型環狀DNA分子，在基因工程中作為最常用，最簡單的載體，必須包括三部分：遺傳標記基因，復制區，目的基因。質粒在所有的細菌類群中都可發現，它們是獨立于細菌染色體外自我復制的DNA分子。自然界中，質粒是在營養充足時出現的，它在結構、大小、復制方式，每個細菌的拷貝數，在不同的細菌體內的繁殖力，在菌種之間的轉移力等方面都會變化，可能最重要的是質粒所攜帶的特征的改變。大多數原核生物的質粒是雙鏈環狀的DNA分子；但是無論是在革蘭式陽性還是陰性菌體內都可以發現線狀質粒。質粒大小變化很大，可從幾個到數百個kb。質粒依靠宿主細胞提供的蛋白質進行復制，但也可以使宿主細胞獲得質粒編碼的功能。質粒復制可以與細菌的細胞周期同步，導致菌體內質粒的拷貝數較低，質粒復制也可獨立于細胞周期，使每個菌體內擴增了成百上千個質粒拷貝。一些質粒在菌種間可自由地轉移它們的DNA分子，另一些只轉移質粒給同種細菌，而有些卻根本不轉移它們的DNA。質粒帶有具有許多功能的基因，這些功能包括對抗生素和重金屬的抗性、對誘變原的敏感性、對噬菌體的易感或抗性、產生限制酶、產生稀有的氨基酸和毒素、決定毒力、降解復雜有機分子，以及形成共生關系的能力和在生物界內轉移DNA的能力等。

質粒上的標記基因按其用途可分為選擇標記基因和篩選標記基因。選擇標記用于鑒別目標DNA（載體）的存在，將成功轉化了載體的宿主挑選出來，篩選標記可用于將特殊表型的重組子挑選出來。目前pUCk57載體上的選擇性標記為氨芐抗性基因，還沒有卡納抗性標記的pUC質粒。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體的構建方法。

本發明的另一目的是提供利用該方法構建的具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體，其特征在于其序列如SEQ?ID?NO.1所示。

上述具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體的構建方法，包括如下步驟：

（1）pUC57骨架克?。阂詐UC57-F：SEQ?ID?NO.2和pUC57-R：SEQ?ID?NO.3為引物，pUC-57載體為模板，通過高保真PCR擴增得到pUC57骨架；

（2）卡那霉素抗性基因克?。阂訟PH-F：SEQ?ID?NO.4和APH-R：SEQ?ID?NO.5為引物，pENTR3C載體為模板，通過高保真PCR擴增得到含有卡那霉素抗性基因的片段；

（3）步驟(1)克隆得到的pUC57骨架和步驟（2）克隆得到的含有卡那霉素抗性基因的片段發生同源重組獲得含有卡那霉素抗性基因的重組pUC-57載體。

所述的同源重組優選將所述的pUC57骨架、所述的含有卡那霉素抗性基因的片段、基因重組緩沖液，基因重組酶（金斯瑞重組克隆試劑盒，L00339）及無菌水混合物孵育30～60分鐘，之后迅速置于冰上冷卻；將所得混合物轉染TOP10化學感受態細菌，將轉化細菌涂布在含有50ug/ml卡那霉素的培養基平板上,37℃過夜培養，挑取單菌落，擴大培養，提取質粒，測序鑒定獲得具有卡那霉素抗性基因的重組pUC-57載體。

所述的同源重組進一步優選將pUC-57骨架與含有卡那霉素抗性基因的片段按照1：1的摩爾比例混合，加入基因重組緩沖液2ul，基因重組酶2ul，加無菌水至20ul，在20～22℃孵育混合物30分鐘，之后迅速將混合物置于冰上2～4分鐘；獲得的混合物20ul，與100ul?TOP10化學感受態細菌混合，轉化條件為冰上30min，42℃熱激90S，立即置于冰上2～4min；加入1ml無抗性的LB活化40～80h，將轉化細菌涂布在含有50ug/ml卡那霉素的培養基平板上。37℃過夜培養，挑取單菌落，擴大培養，提取質粒，測序鑒定獲得具有卡那霉素抗性基因的重組pUC-57載體。

所述的基因重組緩沖液和基因重組酶均來自金斯瑞重組克隆試劑盒。

有益效果：

本發明以現有的pUC57載體為基礎成功構建了具備卡那霉素抗性的重組pUC57載體，提供了其他選擇性標記的質粒載體，具有更廣泛的用途。

附圖說明

圖1重組pUC-57載體構建示意圖。