[發明專利]具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體及其構建方法

無效

• 申請號: 201210178980.5
• 申請日: 2012-06-01
• 公開（公告）號: CN103451217A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 董亢;陳文柱;徐士軍;盧圣東;王珠銀
• 申請（專利權）人: 南京金斯瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 夏平;傅婷婷

1.具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體，其特征在于其序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.權利要求1所述的具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體的構建方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）pUC57骨架克隆：以pUC57-F：SEQ?ID?NO.2和pUC57-R：SEQ?ID?NO.3為引物，pUC-57載體為模板，通過高保真PCR擴增得到pUC57骨架；

（2）卡那霉素抗性基因克隆：以APH-F：SEQ?ID?NO.4和APH-R：SEQ?ID?NO.5為引物，pENTR3C載體為模板，通過高保真PCR擴增得到含有卡那霉素抗性基因的片段；

（3）步驟(1)克隆得到的pUC57骨架和步驟（2）克隆得到的含有卡那霉素抗性基因的片段發生同源重組獲得含有卡那霉素抗性基因的重組pUC-57質粒。

3.根據權利要求2所述的具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體的構建方法，其特征在于所述的同源重組是將所述的pUC57骨架、所述的含有卡那霉素抗性基因的片段、基因重組緩沖液，基因重組酶及無菌水混合物孵育30～60分鐘，之后迅速置于冰上冷卻；將所得混合物轉染TOP10化學感受態細菌，將轉化細菌涂布在含有50ug/ml卡那霉素的培養基平板上,37℃過夜培養，挑取單菌落，擴大培養，提取質粒，測序鑒定獲得具有卡那霉素抗性基因的重組pUC-57質粒。

4.根據權利要求3所述的具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體的構建方法，其特征在于所述的同源重組是將pUC-57骨架與含有卡那霉素抗性基因的片段按照1：1的摩爾比例混合，加入基因重組緩沖液2ul，基因重組酶2ul，加無菌水至20ul，在20～22℃孵育混合物30分鐘，之后迅速將混合物置于冰上2～4分鐘；獲得的混合物20ul，與100ul?TOP10化學感受態細菌混合，轉化條件為冰上30min，42℃熱激90S，立即置于冰上2～4min；加入1ml無抗性的LB活化40～80h，將轉化細菌涂布在含有50ug/ml卡那霉素的培養基平板上。37℃過夜培養，挑取單菌落，擴大培養，提取質粒，測序鑒定獲得具有卡那霉素抗性基因的重組pUC-57質粒。

5.根據權利要求4所述的具有卡那霉素抗性的重組pUC57載體的構建方法，其特征在于所述的基因重組緩沖液和基因重組酶均來自金斯瑞重組克隆試劑盒。