[發(fā)明專利]同時(shí)快速檢測食品中活的鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210177199.6
• 申請日: 2012-06-01
• 公開（公告）號: CN102676684A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏華;許恒毅;萬翠香;楊友均;徐鋒;熊勇華;賴衛(wèi)華
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/42
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種同時(shí)快速檢測食品中活的鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌菌的方法。

技術(shù)背景

????沙門氏菌屬是革蘭氏陰性、兼性厭氧的無芽孢菌。更具目前的分類，沙門氏菌屬只包含兩個(gè)種：邦戈?duì)柹抽T氏菌和腸道沙門氏菌，其中后者包含有2500多種血清型，也是感染人和動(dòng)物最多的。在眾多的血清型中，鼠傷寒沙門氏菌是引起人體食源性致病菌中毒和胃腸炎的一種重要的致病菌，主要流行在發(fā)展中國家，并且對于免疫缺陷性個(gè)體而言，如果感染?該致病菌而未及時(shí)治療則有可能致命。傷寒和副傷寒沙門氏菌主要引起人體的傷寒熱和副傷寒熱，盡管它們已不再發(fā)達(dá)國家流行，但是在發(fā)展中國家，例如亞洲和非洲北部地區(qū)，這些致病菌仍然還在引發(fā)嚴(yán)重的疾病。據(jù)估計(jì)，在全世界，每年有22000萬的沙門氏菌感染，其中死亡人數(shù)為20萬。在南亞地區(qū)約有四分之一的腸熱癥是有副傷寒沙門氏菌引起。沙門氏菌主要感染居住環(huán)境擁擠，食物和飲水不衛(wèi)生的人群，其中使用受污染的食物是組成沙門氏菌感染的主要途徑，大約有95%的感染是有食用受污染的食物引起的。

目前現(xiàn)存的檢測該沙門氏菌的方法主要是通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。如(楊瑞軍,?生肉食品中致病菌檢測結(jié)果分析[J]中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志.2009:19（9）2122-2125)，傳統(tǒng)方法具有勞動(dòng)強(qiáng)度高、耗時(shí)、費(fèi)用高等缺點(diǎn)。因此需要更快速檢測3種致病菌的方法。

發(fā)明內(nèi)容

????本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的能同時(shí)檢測活的鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌菌的方法。該方法可用于食品樣本中活的鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌菌的初篩檢測，其操作簡便、結(jié)果客觀準(zhǔn)確，避免了現(xiàn)有方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高昂的缺點(diǎn)。

????本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，

本發(fā)明涉及一種疊氮溴化丙錠處理結(jié)合多重PCR同時(shí)快速檢測食品中活的鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌菌的方法，包括如下步驟：

?(1)取食物樣本，加緩沖液碾磨制成勻漿液，離心去除加大的食物殘?jiān)?，取上清得菌懸液，整過程均為無菌操作；

?(2)取制備好的菌懸液加疊氮溴化丙啶?（PMA）溶液?，使PMA的終質(zhì)量濃度為3?μg/mL，混勻后室溫避光培養(yǎng)3-8min（優(yōu)選為5min），鹵素?zé)羝毓?，光照交?lián)時(shí)樣品置于冰上，交聯(lián)后的懸浮液離心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；

（3）所得DNA進(jìn)行mPCR，體系包含總共10μl反應(yīng)液，其中，4?μl?制備的模板DNA溶液，2?μl?5×buffer，每條引物的量是15?pmol，1U?Taq?DNA聚合酶;反應(yīng)條件是：95℃?10?min，接著94℃?30?s，?50℃?30?s，72℃?1?min?40個(gè)循環(huán)，最后?72℃?延伸10?min；

（4）mPCR?反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行目的菌檢測分析。

步驟（1）所述的緩沖液為PBS磷酸鹽緩沖液。

步驟（3）所述引物分別為：從5’-3’為

fliC-F:TGCGCTGAATGAAATCAACAAC

fliC-R:TAGAAACCGTACCATTACCGTC

Hat-F:ACTCAGGCTTCCCGTAACGC

Hat-R:GCTTCATACAGACCATCTTTAGTTG

stgA-F:TGCCAGGTTACGCCACAAACC

stgA-R:CGCTGTGGTATCAATCGTGC?

步驟（4）所述目的菌檢測分析為用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果，若有636?bp條帶，則說明有鼠傷寒沙門氏菌，若有551?bp條帶，則說明有乙型副傷寒沙門氏菌，若有354?bp條帶，則說明有傷寒沙門氏菌菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下有益效果：

1、能同時(shí)檢測鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌菌，速度快，可以在4小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果。

2、只檢測具有致病性的活菌，效率更高。

3、本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物，采用特定反應(yīng)條件，靈敏度高?？赏瑫r(shí)、高效地檢測出該3種目的菌，操作簡便，結(jié)果判定簡單，降低了檢測成本。

附圖說明