[發明專利]快速檢測食品中單核增生李斯特菌的方法

有效

• 申請號: 201210177173.1
• 申請日: 2012-06-01
• 公開（公告）號: CN102719535A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 魏華;徐鋒;楊友均;郭亮;許恒毅;賴衛華;熊勇華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

1.一種快速檢測食品中活的單核增生李斯特菌（Listeria?monocytogenes）的檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）取食物樣本，加緩沖液碾磨制成勻漿液，離心去除大的食物殘渣，取上清得菌懸液，整過程均為無菌操作；

（2）取制備好的菌懸液加疊氮溴化丙啶溶液，使疊氮溴化丙啶的終質量濃度為3?μg/mL，混勻后室溫避光培養3~8min，鹵素燈曝光，光照交聯時樣品置于冰上，交聯后的懸浮液離心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；

（3）取DNA，進行LAMP反應，LAMP反應所用的引物為：

上游外引物F3（5’→3’）：?AAGCTGCTTTTGATGCTG

下游外引物B3（5’→3’）：?TCGATTAAAAGTAGCGCCTT

上游內引物FIP（5’→3’）：CGGCTTTGAAGGAAGAATTTTTGAT-CGTAAGCGGAAAATCTGTC

下游內引物BIP（5’→3’）：TACGGAGGTTCCGCAAAAGA-TTTTCAAAATATCGCGTAAGTCTC

上游環引物LF（5’→3’）：?ATTTGTTAGTTCTACATCACCTG

下游環引物LB（5’→3’）:?AAGTTCAAATCATCGACGGC

（4）?LAMP反應結束后，取反應液檢測單核增生李斯特菌存在。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）所述的緩沖液為PBS磷酸鹽緩沖液。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）所述PMA溶液配制方法為PMA溶解于二甲亞砜(?DMSO)?中，配制成0.5?mg/mL的PMA溶液，-20℃避光保存。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）中混勻后室溫避光培養5min。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3）所述LAMP反應條件為：0.8?M?甜菜堿,?2?mM?MgSO4,?1.4?mM?dNTP,?1.6?uM內引物?FIP/BIP,?0.4?uM?外引物F3/B3,?0.8?uM?環引物LF/LB；將擴增反應體系于62?^oC孵育45?min，85?^oC?孵育5?min，終止反應。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（4）所述取反應液檢測單核增生李斯特菌存在為取反應液用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，若有梯度條帶處在，且最小條帶為180?bp，則說明有單核增生李斯特菌存在；或取反應液加入SYBR?green?I熒光檢測，若反應液出現綠色，則說明有單核增生李斯特菌存在。