[發明專利]快速檢測食品中單核增生李斯特菌的方法

有效

• 申請號: 201210177173.1
• 申請日: 2012-06-01
• 公開（公告）號: CN102719535A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 魏華;徐鋒;楊友均;郭亮;許恒毅;賴衛華;熊勇華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

????本發明屬于微生物檢測領域，尤其涉及一種快速檢測食品中單核增生李斯特菌的方法。

技術背景

???目前，李斯特菌屬共包含8個種，而絕大多數人體感染的李斯特菌都與單核增生李斯特菌（L.?monocytogenes）有關。對于非孕婦的的個體，單核增生李斯特菌感染會引起腦膜炎和腦膜腦炎；對于孕婦，主要感染還未出生的嬰兒。在感染過程中單核增生李斯特菌可以從一個細胞擴散到鄰近的其他細胞。通常單核增生李斯特菌會在腐爛的植物體和泥土中發現，同時它也會通過飲水和食物進入家畜的體內并定植在其胃腸道。人體會因食用受感染的家畜的肉或奶而患病。食用受單核增生李斯特菌污染的食物，例如干酪、香腸、牛奶等，是其感染的主要途徑，其致死率可高達30%。

供食用的家畜及其相關產品是單核增生李斯特菌污染的主要來源。因此，為了確保食品安全，在食物生產的各個環節控制微生物的污染相當重要。目前，對于單核增生李斯特菌檢測主要的方法還是培養法和血清學的檢測方法，包括富集、選擇性培養、生化鑒定。血清分型，有時還要進行毒性檢測。如(楊瑞軍,?生肉食品中致病菌檢測結果分析[J]中國衛生檢驗雜志.2009:19（9）2122-2125)，傳統的方法具有勞動強度高、耗時、費用高等缺點。此外，傳統方法檢測靈敏度比較低而且特異性不強，尤其對于來源相近的菌株，傳統方法很難通過生理生化的方式加以區分。因此，為了確保食品安全，急需快速、簡單、準確的方法來檢測食品中的單核增生李斯特菌。

發明內容

????本發明是目的是針對現有技術的不足，提供一種檢測成本低、使用方便、檢測快速高效、靈敏度高的單核增生李斯特菌快速檢測方法。

?本發明的上述目的是通過如下技術方案予以實現的：

包括如下步驟：

（1）取食物樣本，加緩沖液碾磨制成勻漿液，離心去除大的食物殘渣，取上清得菌懸液，整過程均為無菌操作；緩沖液為PBS磷酸鹽緩沖液。

（2）取制備好的菌懸液加疊氮溴化丙啶（PMA）溶液，使PMA的終質量濃度為3?μg/mL，混勻后室溫避光培養3?~8min（優選為5min），鹵素燈曝光，光照交聯時樣品置于冰上，交聯后的懸浮液離心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；PMA溶液配制方法為PMA溶解于二甲亞砜(?DMSO)?中，配制成0.5?mg/mL的PMA溶液，-20℃避光保存。

（3）取DNA，進行LAMP反應，LAMP反應所用的引物為：

上游外引物F3（5’→3’）：?AAGCTGCTTTTGATGCTG

下游外引物B3（5’→3’）：?TCGATTAAAAGTAGCGCCTT

上游內引物FIP（5’→3’）：CGGCTTTGAAGGAAGAATTTTTGAT-CGTAAGCGGAAAATCTGTC

下游內引物BIP（5’→3’）：TACGGAGGTTCCGCAAAAGA-TTTTCAAAATATCGCGTAAGTCTC

上游環引物LF（5’→3’）：?ATTTGTTAGTTCTACATCACCTG

下游環引物LB（5’→3’）:AAGTTCAAATCATCGACGGC

為了達到更好的反應效果，LAMP反應條件為：0.8?M?甜菜堿,?2?mM?MgSO4,?1.4?mM?dNTP,?1.6?uM內引物?FIP/BIP,?0.4?uM?外引物F3/B3,?0.8?uM?環引物LF/LB；將擴增反應體系于62?^oC孵育45?min，85?^oC?孵育5?min，終止反應。

（4）?LAMP反應結束后，取反應液檢測單核增生李斯特菌存在。取反應液檢測單核增生李斯特菌存在可以為取反應液用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，若有梯度條帶處在，且最小條帶為180?bp，則說明有單核增生李斯特菌存在；或取反應液加入SYBR?green?I熒光檢測，若反應液出現綠色，則說明有單核增生李斯特菌存在。

與現有技術相比，本發明有如下有益效果：

1、采用本發明的檢測單核增生李斯特菌的時間更短，可在2.5個小時內得到結果，同時本發明克服了一般的分子生物學檢測方法無法區分死菌與活菌的缺陷；

2、本發明針對單核增生李斯特菌的特異性基因設計特異性引物，并特定的反應條件，可在62°C,?45?min內的出結果。

3、取反應液檢測單核增生李斯特菌存在，可以無需電泳檢測，直接可通過熒光觀察，操作簡便，結果判定簡單，降低了檢測成本。