[發明專利]一種轉化野生型枯草芽孢桿菌的方法

有效

• 申請號: 201210177083.2
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN102649967A
• 公開（公告）日: 2012-08-29
• 發明（設計）人: 王琦;汝津江;李燕
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及細菌轉化領域，具體的涉及一種轉化野生型枯草芽孢桿菌的方法。

背景技術

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性細菌，廣泛存在于自然界中，很多植物內生和土壤習居枯草芽孢桿菌是潛在的植物病害生物防治因子，建立相應轉化體系是對菌株進行熒光標記以原位監測其定殖、分布規律的前提。轉化是指細菌攝取外界環境中DNA的過程，細菌能夠通過自然轉化適應復雜的外界環境，轉化的發生可能會造成基因克隆、突變體產生和基因圖譜等現象。

枯草芽孢桿菌轉化機制研究表明，細胞感應外界信號后經過一系列調控途徑誘導感受態形成因子ComK的產生，ComK再調控一系列后期感受態形成基因（late?competence?genes）表達，這些基因編碼細胞膜上識別并接受外源DNA的復合體和胞內保護酶等產物，目前所有轉化的發生都需要細胞處于感受狀態，這樣才可能轉化成功，因此制備性能良好的感受態細胞是實現枯草芽孢桿菌轉化的關鍵步驟。

傳統轉化方法很難在實驗室條件下實現野生型枯草芽孢桿菌的人工轉化，許多已經成功轉化的菌株是經過遺傳改良或是適應了實驗室條件的菌株。對于野生型枯草芽孢桿菌人工轉化來說，現有的方法主要是自然轉化法、原生質體轉化法和傳統電擊轉化法等。自然轉化法操作簡單，但成功率極低，該方法中的培養基誘導細胞進入感受狀態這一步十分關鍵，加入質粒后發生自然轉化的概率很低。原生質體轉化法轉化率相對較高，但步驟繁瑣，加入溶菌酶的量及處理時間、聚乙二醇（PEG）的處理方法及處理時間、細胞壁的再生及轉化子篩選等步驟非常關鍵，很難把握。傳統電擊轉化法使用較多，操作相對簡便，但轉化效率不高，電壓（電容與電阻的設置）和時間常數是關鍵參數。

發明內容

本發明的目的是提供一種轉化野生型枯草芽孢桿菌的方法。

本發明提供的轉化野生型枯草芽孢桿菌的方法，包括制備感受態細胞和電擊轉化兩個步驟；

所述制備感受態細胞依次包括如下步驟：

（1）將野生型枯草芽孢桿菌接種至生長培養基，使野生型枯草芽孢桿菌的初始濃度為1.8×10⁷-7.7×10⁷cfu/mL（如1.8×10⁷-5×10⁷CFU/mL或5×10⁷-7.7×10⁷CFU/mL），35-37℃（如35-36℃或36-37℃）振蕩培養2-3.5h（如2-3h或3-3.5h）；所述生長培養基的溶劑為水（如雙蒸水），溶質及其濃度如下：硫酸銨1.8-2.2g/L（如1.8-2g/L或2-2.2g/L）、磷酸氫二鉀14-16g/L（如14-14.8g/L或14.8-16g/L）、檸檬酸三鈉1.5-2.5g/L（如1.5-1.9g/L或1.9-2.5g/L）、硫酸鎂0.09-0.1g/L（如0.09-0.098g/L或0.098-0.1g/L）、葡萄糖4.8-5.2g/L（如4.8-5g/L或5-5.2g/L）和酪蛋白水解物0.18-0.22g/L（如0.18-0.2g/L或0.2-0.22g/L）；

（2)將1體積份完成步驟(1)的培養體系與0.8-1.2體積份（如0.8-1體積份或1-1.2體積份）誘導培養基混勻，35-37℃（如35-36℃或36-37℃）振蕩培養1.5-3.5h（如1.5-3h或3-3.5h）；所述誘導培養基的溶劑為水（如雙蒸水），溶質及其濃度如下：硫酸銨1.8-2.2g/L（如1.8-2g/L或2-2.2g/L）、磷酸氫二鉀14-16g/L（如14-14.8g/L或14.8-16g/L）、檸檬酸三鈉1.5-2.5g/L（如1.5-1.9g/L或1.9-2.5g/L）、硫酸鎂0.09-0.1g/L（如0.09-0.098g/L或0.098-0.1g/L）和葡萄糖4.8-5.2g/L（如4.8-5g/L或5-5.2g/L）；

所述電擊轉化包括如下步驟：將待轉化的質粒與所述感受態細胞混勻并冰浴，然后采用1.2-1.8kV（如1.2-1.5kV或1.5-1.8kV）的電壓進行電擊，得到導入所述待轉化質粒的重組枯草芽孢桿菌。