[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)化野生型枯草芽孢桿菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210177083.2
• 申請(qǐng)日: 2012-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN102649967A
• 公開（公告）日: 2012-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王琦;汝津江;李燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/75
• 分類號(hào): C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

1.一種轉(zhuǎn)化野生型枯草芽孢桿菌的方法，包括制備感受態(tài)細(xì)胞和電擊轉(zhuǎn)化兩個(gè)步驟；

所述制備感受態(tài)細(xì)胞依次包括如下步驟：

（1）將野生型枯草芽孢桿菌接種至生長(zhǎng)培養(yǎng)基，使野生型枯草芽孢桿菌的初始濃度為1.8×10⁷-7.7×10⁷CFU/mL，35-37℃振蕩培養(yǎng)2-3.5h；所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：硫酸銨1.8-2.2g/L、磷酸氫二鉀14-16g/L、檸檬酸三鈉1.5-2.5g/L、硫酸鎂0.09-0.1g/L、葡萄糖4.8-5.2g/L和酪蛋白水解物0.18-0.22g/L；

（2)將1體積份完成步驟(1)的培養(yǎng)體系與0.8-1.2體積份誘導(dǎo)培養(yǎng)基混勻，35-37℃振蕩培養(yǎng)1.5-3.5h；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：硫酸銨1.8-2.2g/L、磷酸氫二鉀14-16g/L、檸檬酸三鈉1.5-2.5g/L、硫酸鎂0.09-0.1g/L和葡萄糖4.8-5.2g/L；

所述電擊轉(zhuǎn)化包括如下步驟：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒與所述感受態(tài)細(xì)胞混勻并冰浴，然后采用1.2-1.8kV的電壓進(jìn)行電擊，得到導(dǎo)入所述待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的重組枯草芽孢桿菌。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒與所述感受態(tài)細(xì)胞的配比為：100ng-5μg所述待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒：0.2×10⁹CFU-0.49×10⁹CFU感受態(tài)細(xì)胞。

3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述制備感受態(tài)細(xì)胞還包括如下步驟（3）：將完成所述步驟（2）的培養(yǎng)體系冰浴30min，然后4℃離心收集細(xì)胞。

4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述電擊轉(zhuǎn)化中，所述冰浴的時(shí)間為30min。

5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述電擊轉(zhuǎn)化中，所述電擊的電阻為200Ω、電容為25μF。

6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述電擊轉(zhuǎn)化還包括在所述電擊后進(jìn)行如下處理的步驟：向電擊杯中加入700-1000μL?30-37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基并混勻，然后30-37℃振蕩培養(yǎng)3h。

7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒為穿梭載體pBE2、穿梭載體pS4GFP或穿梭載體pMarA。

8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述野生型枯草芽孢桿菌為未經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的枯草芽孢桿菌。