[發(fā)明專利]一種表達(dá)植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210176806.7
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN102660469A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊謙;王允;宋金柱;從華;孫艷;曹廣麗;姚琳;楊萍;趙磊;王震宇;劉冰南
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/31;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 韓末洙

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種表達(dá)植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

目前全世界每年因為病蟲害而損失的糧食達(dá)數(shù)億噸，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億美元，隨著人口的不斷增長，糧食安全仍然是待解決的一大難題。生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥相比，起作用的是生物活性或產(chǎn)生的活性物質(zhì)，相對具有無殘留、無污染，對環(huán)境更加友好的優(yōu)勢，能兼顧生態(tài)平衡，且病蟲害不容易產(chǎn)生抗藥性。由于生物防治能克服化學(xué)農(nóng)藥的種種弊端而成為被優(yōu)先采用的方法，受到了國際社會的極大關(guān)注。

生物防治菌能夠通過各種不同的機(jī)制抑制病原菌的生長，故而在學(xué)術(shù)研究和工業(yè)生產(chǎn)中，都引起了廣泛的重視，且被普遍認(rèn)為是能夠替代多種化學(xué)農(nóng)藥的最具希望和潛力的生防因子。生防菌通過多種機(jī)制包括重寄生作用、溶菌作用、抗生素作用，以及對空間和營養(yǎng)的競爭等達(dá)到防治植物病原菌的目的。

來源于綠木霉的植物抗性誘導(dǎo)因子已被純化，該植物抗性誘導(dǎo)因子具有植物抗病作用但目前其編碼基因在絲狀真菌中表達(dá)量較低，純化后的產(chǎn)量約為150μg/L，無法滿足其研究與應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是要解決目前綠木霉的植物抗性誘導(dǎo)因子基因表達(dá)量低，無法滿足其研究與應(yīng)用的問題，提供一種表達(dá)植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法。

本發(fā)明表達(dá)植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行：一、將棘孢木霉接種到PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，3天后將孢子用無菌水清洗，接入PDA液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3天后離心收集菌絲，用Trizol提取菌絲的總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；二、以獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，獲得目的基因EplT4，對目的基因EplT4進(jìn)行測序鑒定；三、將目的基因EplT4與質(zhì)粒載體pPIC9K分別經(jīng)EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，將酶切后的目的基因EplT4和酶切后的質(zhì)粒載體pPIC9K連接，構(gòu)建重組載體pPIC9K-EplT4；四、將重組載體pPIC9K-EplT4轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗證，用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒用SalI酶進(jìn)行單酶切線性化，并將線性化片段進(jìn)行回收；五、用畢赤酵母GS115制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，將線性化片段與畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混合，電擊轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞；六、將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂在MD平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)至長出重組菌，將重組菌分別轉(zhuǎn)接到含梯度濃度G418抗生素的MD平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)，在最高濃度G418抗生素的培養(yǎng)基上生長的菌落，即為畢赤酵母基因工程菌株P(guān)p-EplT4；其中步驟二中PCR擴(kuò)增所用上游引物Pa為5′-CGGAATTCGATACCGTCTCGTACGATACCGGCT-3′，下游引物Pb為5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGATGGTGATGGTGATGGAGGCCGCAGTTGCTCACAGC-3′；步驟四中菌落PCR所用上游引物Pc為5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′，下游引物Pd為5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明方法獲得的畢赤酵母基因工程菌株P(guān)p-EplT4可高效表達(dá)棘孢木霉的植物抗性誘導(dǎo)因子基因(EplT4)，表達(dá)量為20mg/L。本發(fā)明從三個層面來證明EplT4能誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生抗病性的問題。首先，在基因水平上，EplT4能夠誘導(dǎo)大豆的病原相關(guān)蛋白基因表達(dá)量的上調(diào)，幾丁質(zhì)酶，葡聚糖酶等基因的高表達(dá)，能有效抑制外來病源的侵染；其次，在生理生化水平上，植物抗性反應(yīng)的前期是產(chǎn)生過氧化氫和植物抗毒素(往往與產(chǎn)生熒光相關(guān)聯(lián))，EplT4能分別誘導(dǎo)大豆葉片產(chǎn)過氧化氫和熒光現(xiàn)象說明，大豆已經(jīng)產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性；最后，在抗病原菌水平上，EplT4能抑制大豆灰斑病在葉片上的發(fā)病情況，這說明它提高大豆對灰斑病的抗病能力。

附圖說明