[發(fā)明專利]一種表達植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210176806.7
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN102660469A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊謙;王允;宋金柱;從華;孫艷;曹廣麗;姚琳;楊萍;趙磊;王震宇;劉冰南
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/31;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 韓末洙

1.一種表達植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于表達植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，按以下步驟進行：一、將棘孢木霉接種到PDA培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，3天后將孢子用無菌水清洗，接入PDA液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3天后離心收集菌絲，用Trizol提取菌絲的總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；二、以獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用膠回收試劑盒進行純化，獲得目的基因EplT4，對目的基因EplT4進行測序鑒定；三、將目的基因EplT4與質(zhì)粒載體pPIC9K分別經(jīng)EcoRI和NotI進行雙酶切，將酶切后的目的基因EplT4和酶切后的質(zhì)粒載體pPIC9K連接，構(gòu)建重組載體pPIC9K-EplT4；四、將重組載體pPIC9K-EplT4轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑選轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證，用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒用SalI酶進行單酶切線性化，并將線性化片段進行回收；五、用畢赤酵母GS115制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，將線性化片段與畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混合，電擊轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞；六、將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂在MD平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)至長出重組菌，將重組菌分別轉(zhuǎn)接到含梯度濃度G418抗生素的MD平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)，在最高濃度G418抗生素的培養(yǎng)基上生長的菌落，即為畢赤酵母基因工程菌株P(guān)p-EplT4；其中步驟二中PCR擴增所用上游引物Pa為5′-CGGAATTCGATACCGTCTCGTACGATACCGGCT-3′，下游引物Pb為5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGATGGTGATGGTGATGGAGGCCGCAGTTGCTCACAGC-3′；步驟四中菌落PCR所用上游引物Pc為5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′，下游引物Pd為5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中PCR擴增的反應(yīng)體系如下：

PCR擴增條件為：94℃變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)，再72℃延伸7min，4℃保溫。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中目的基因EplT4的雙酶切反應(yīng)體系如下：

酶切反應(yīng)條件：16℃酶切過夜。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中質(zhì)粒載體pPIC9K的雙酶切反應(yīng)體系如下：

酶切反應(yīng)條件：16℃酶切過夜。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中連接反應(yīng)體系如下：

連接反應(yīng)條件：16℃連接過夜。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達植物抗性誘導(dǎo)因子的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中PCR擴增的反應(yīng)體系如下：

PCR擴增條件為：94℃變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共28個循環(huán)，再72℃延伸7min，12℃保溫。