[發明專利]β-1，4-內切木聚糖酶工程菌的構建及其酶的應用

無效

• 申請號: 201210174569.0
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102816728A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 馮雁;謝云龍;田東升;安嬌;楊廣宇
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/42;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術領域

本發明涉及生物技術，具體涉及一種β-1，4-內切木聚糖酶工程菌的構建、利用該工程菌制備的嗜熱木聚糖酶及該酶在工業中的應用。

背景技術

木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一類酶的總稱。它是一種多聚五碳糖，是植物半纖維素的重要組分，它占植物碳水化合物總量的三分之一，在自然界中是繼纖維素之后含量第二豐富的可再生生物資源。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一類酶的總稱。它可以將木聚糖降解為寡聚木糖、木糖和少量單糖。它在飼料、造紙、食品、制藥以及能源工業中均有著廣泛的應用。

β-1，4-內切木聚糖酶能夠專一降解木聚糖為低聚木糖和木糖，主要從主鏈內部作用于木糖苷鍵。其作用方式是在不同位點上作用于木聚糖和長鏈木寡糖，從β-1，4-D-木聚糖主鏈的內部切割木糖苷鍵，從而使木聚糖降解為木寡糖。其水解產物主要為木二糖與木二糖以上的低聚木糖，也有少量的木糖、阿拉伯糖和甘露糖微生物中木聚糖酶。根據木聚糖酶催化區域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中糖苷水解酶以第10家族和第11家族居多。由于來源菌株不同而導致其理化性質和分子量不盡相同，其分子量分布在7.7-150kDa，最適pH值分布在2-11。在過去20年中，有大量的木聚糖酶被分離純化出來，它們的基因已經被克隆，并在大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母等系統中進行了表達。當前，木聚糖酶的應用領域不斷擴大，它在造紙、食品、飼料、紡織、釀酒、醫藥、環境和能源等工業都有應用。但能夠應用于工業生產的天然木聚糖酶卻很少，工業用酶要求有較高的酶活性，良好的pH穩定性及熱穩定性。到目前為止，國內有關木聚糖酶產生菌的報道較多，其中以真菌的研究居多，而細菌類研究偏少。

Caldicellulosiruptor?bescii?DSM?6725是實驗室購買的一株木聚糖酶產生菌株，可以在70-75℃的條件下生長，我們由此推斷它所產生的木聚糖酶具有良好的熱穩定性，具備應用于工業生產的潛力。我們應用轉基因技術，將嗜熱菌中的相關基因轉接到更易培養的大腸桿菌中以高效表達。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種能應用于工業的嗜熱內切木聚糖酶；

本發明的目的之二是提供編碼上述嗜熱木聚糖酶的基因；

本發明的目的之三是提供包含上述嗜熱木聚糖酶基因的重組菌株；

本發明的目的之四是提供一種制備上述嗜熱木聚糖酶的基因工程菌的構建方法；

本發明的目的之五是提供上述嗜熱木聚糖酶的應用。

本發明中的內切木聚糖酶工程菌已于2011年12月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。保藏編號為CGMCC?No.5596。其分類命名為：大腸埃希氏菌，拉丁名：Escherichia?coli。

為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：一種β-1，4-內切木聚糖酶工程菌，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，命名為木聚糖酶基因Cb?Xyn10C。

所述木聚糖酶基因Cb?Xyn10C來源于熱解纖維素菌（Caldicellulosiruptor?besciiDSM?6725）。

上述β-1，4-內切木聚糖酶工程菌的構建方法，包括以下步驟：

Ａ、基因組DNA的提取

取5ml小試管培養的Caldicellulosiruptor?bescii?DSM?6725，用細菌基因組DNA小量提取試劑盒提取細菌的基因組，得到基因組DNA溶液；

Ｂ、引物設計及用PCR法提取木聚糖酶目的基因

引物設計如下：

上游引物：5′GGGTCGCGGATCCATAGAAACTACTAAAAC?3′，劃線部分為BamH?Ⅰ的酶切位點；

下游引物：5′GGTGGTGCTCGAGTTATTCTTCTGGCACAACTG?3′，劃線部分為Xho?Ⅰ的酶切位點；

以步驟Ａ所得基因組DNA溶液為模板，在上述上游引物和下游引物的參與下進行PCR反應，得到擴增產物，再對擴增產物用擴增產物純化試劑盒進行純化，得到純化的PCR產物，然后用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，37℃下保溫2小時，然后用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，再用DNA凝膠檢測試劑盒回收酶切后的目的基因片段，得到Cb?Xyn10C，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；