[發明專利]β-1，4-內切木聚糖酶工程菌的構建及其酶的應用

無效

• 申請號: 201210174569.0
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102816728A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 馮雁;謝云龍;田東升;安嬌;楊廣宇
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/42;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

1.一種β-1，4-內切木聚糖酶工程菌，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，命名為木聚糖酶基因Cb?Xyn10C。

2.如權利要求1所述的β-1，4-內切木聚糖酶工程菌，其特征在于：所述木聚糖酶基因Cb?Xyn10C來源于熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor?bescii?DSM?6725)。

3.如權利要求1所述的一種β-1，4-內切木聚糖酶工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、基因組DNA的提取

取5ml小試管培養的Caldicellulosiruptor?bescii?DSM?6725，用細菌基因組DNA小量提取試劑盒提取細菌的基因組，得到基因組DNA溶液；

B、引物設計及用PCR法提取木聚糖酶目的基因

引物設計如下：

上游引物：：5′GGGTCGCGGATCCATAGAAACTACTAAAAC?3′，劃線部分為BamH?I的酶切位點；

下游引物：5′GGTGGTGCTCGAGTTATTCTTCTGGCACAACTG?3′，劃線部分為Xho?I的酶切位點；

以步驟A所得基因組DNA溶液為模板，在上述上游引物和下游引物的參與下進行PCR反應，得到擴增產物，再對擴增產物用擴增產物純化試劑盒進行純化，得到純化的PCR產物，然后用限制性內切酶BamH?I和Xho?I進行雙酶切，37℃下保溫2小時，然后用0.8％的瓊脂糖凝膠進行電泳，再用DNA凝膠檢測試劑盒回收酶切后的目的基因片段，得到Cb?Xyn10C，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；

C、構建重組表達載體

以pET28a為載體，對載體用限制性內切酶BamH?I和Xho?I進行雙酶切，37℃下保溫2小時，再用磷酸酶(FastAP)處理去磷酸化，反應20分鐘，用0.8％的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用膠回收試劑盒回收線性載體片段；

然后將目的基因片段與線性載體片段利用T4DNA連接酶連接，得到重組表達載體；

D、將重組表達載體轉化到宿主細胞中

將步驟C所得重組表達載體轉入大腸桿菌BL21(DE3)Codon?Plus中，用含50μg/ml卡那霉素的LB固體培養基進行陽性克隆篩選，得到含有目的基因的大腸桿菌工程菌。

4.如權利要求3所述的β-1，4-內切木聚糖酶工程菌的構建方法，其特征在于：所述的PCR反應的反應體系按以下方法配制：DNA聚合酶(Primer?star)1μl，DNA聚合酶緩沖液(Primer?star?buffer)20μl，作為模板的基因組DNA溶液2μl，2.5mM脫氧核苷酸混合物(dNTP)8μl，上下游引物各加40pmol，加超純水至總體積100μl；所述的PCR反應的反應程序為：95℃預變性3min；然后95℃變性30s，57℃退火10s，72℃延伸120s，再72℃延伸15min，共30個循環。

5.如權利要求3所述的β-1，4-內切木聚糖酶工程菌的構建方法，其特征在于：步驟C所述的用限制性內切酶BamH?I和Xho?I進行雙酶切的酶切體系包括：pET28a空載體45μl，上下游引物各2μl，FD-buffer?7μl，加ddH₂O?14μl至總體積70μl。

6.如權利要求3所述的β-1，4-內切木聚糖酶工程菌的構建方法，其特征在于：所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每種核苷酸的濃度均為25nmol/L。

7.一種用權利要求1或3所述的β-1，4-內切木聚糖酶工程菌制備的嗜熱木聚糖酶，其特征在于：所述的嗜熱木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，該嗜熱內切木聚糖酶的最適反應溫度為68℃，最適pH為6.7。

8.一種如權利要求7所述的嗜熱木聚糖酶的制備方法，其特征在于：將含有目的基因的大腸桿菌工程菌進行放大培養，然后通過超聲破碎、對雜蛋白熱失活，并通過進一步的分離純化，即得到嗜熱木聚糖酶。

9.一種如權利要求7所述的嗜熱木聚糖酶的應用，其特征在于：所述的嗜熱木聚糖酶用于造紙、食品、飼料、紡織和能源的生產領域中。