[發(fā)明專利]克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的引物對及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210174438.2
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN102747071A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張振臣;秦艷紅;喬奇;張德勝;田雨婷;王爽;王永江
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12R1/94
• 代理公司: 鄭州大通專利商標(biāo)代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的引物對及方法。

背景技術(shù)

甘薯褪綠矮化病毒(Sweet?potato?chlorotic?stunt?virus，SPCSV)屬于長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus)成員。SPCSV可與馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的甘薯羽狀斑駁病毒協(xié)生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害SPVD（sweet?potato?virus?disease，SPVD）。SPVD是甘薯上的毀滅性病害，通常可使甘薯減產(chǎn)50%～98%，甚至絕收。我國自2010年首次發(fā)現(xiàn)SPCSV以來，目前在全國多個(gè)甘薯種植區(qū)陸續(xù)檢測到該病毒病的存在，嚴(yán)重威脅我國的甘薯產(chǎn)業(yè)。

分離克隆該病毒基因組的全長序列，進(jìn)一步研究病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能，有助于探索更有效的抗病毒基因工程途徑，對于SPVD的防治具有重要意義。SPCSV的基因組為雙組分單鏈正義RNA，基因組大小為17.6?kb左右，其基因組是已知的植物病毒中第二大的單鏈正義RNA病毒。分離克隆植物病毒全基因組的常規(guī)方法是首先提純病毒，然后利用純化病毒的RNA或感染病毒的植物葉片的總RNA進(jìn)行克隆。由于SPCSV常常與多種病毒混合侵染甘薯，分離純化極為困難，而且該病毒在甘薯體內(nèi)含量很低，利用常規(guī)的克隆方法很難獲得SPCSV基因組全長序列。因此，截止目前，國際上僅獲得了兩個(gè)SPCSV分離物的全基因組序列，國內(nèi)尚未見有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一組能使擴(kuò)增片段相互重疊且覆蓋SPCSV基因組兩條RNA近全長序列的引物對；還提供了一種簡便、有效的克隆甘薯褪綠矮化病毒全基因組的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種用于克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的引物對，包括五對引物，其核苷酸序列依次為：

RNA1-1-5'?????????5’-GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’

RNA1-2989-3'??????5’-ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’；

RNA1-2420-5'?????5’-AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’

RNA1-5596-3'?????5’-GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’；

RNA1-4410-5'?????5’-GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’

RNA1-8637-3'?????5’-AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’；

RNA2-53-5'??????5’-CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’

RNA2-5599-3'????5’-CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’?；

RNA2-4440-5'?????5’-ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’

RNA2-8223-3'?????5’-GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’?。

一種克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的方法，包括如下步驟：

（1）按照上述五組引物核苷酸序列分別合成出對應(yīng)的引物；

（2）將感染SPCSV的甘薯植株種植于防蟲溫室內(nèi)，并以其飼養(yǎng)煙粉虱，收集以該感染SPCSV的甘薯植株飼養(yǎng)至少3天的煙粉虱用液氮速凍后，置于-70℃下保存?zhèn)溆茫?!-- SIPO -->

（3）取上步所得煙粉虱至少10頭，放入加有預(yù)冷RNA提取液的離心管中，提取煙粉虱的總RNA作為PCR模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；

（4）以上步所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，分別利用上述步驟（1）所得的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為2.9kb、3.2kb、4.2kb、5.6kb和3.8kb；

（5）用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別與pMD19-T載體連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克隆；核苷酸序列測定由TaKaRa公司完成，測序完成后，對5個(gè)片段進(jìn)行拼接，即獲得SPCSV基因組全長序列。