[發(fā)明專利]克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的引物對及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210174438.2
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN102747071A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張振臣;秦艷紅;喬奇;張德勝;田雨婷;王爽;王永江
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12R1/94
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

1.一種克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的引物對，包括五對引物，其核苷酸序列依次為：

RNA1-1-5'?????????5’-GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’

RNA1-2989-3'??????5’-ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’；

RNA1-2420-5'?????5’-AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’

RNA1-5596-3'?????5’-GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’；

RNA1-4410-5'?????5’-GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’

RNA1-8637-3'?????5’-AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’；

RNA2-53-5'??????5’-CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’

RNA2-5599-3'????5’-CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’；

RNA2-4440-5'?????5’-ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’

RNA2-8223-3'?????5’-GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’?。

2.一種克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的方法，包括如下步驟：

（1）按照權(quán)利要求1所述的引物核苷酸序列合成出五對引物；

（2）將感染SPCSV的甘薯植株種植于防蟲溫室內(nèi)，并以其飼養(yǎng)煙粉虱，收集以該感染SPCSV的甘薯植株飼養(yǎng)至少3d的煙粉虱用液氮速凍后，置于-70℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）取上步所得煙粉虱至少10頭，放入加有預(yù)冷RNA提取液的離心管中，提取煙粉虱的總RNA作為PCR模板，進行反轉(zhuǎn)錄；

（4）以上步所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，分別利用所述步驟（1）所得的引物進行PCR擴增，預(yù)期擴增片段大小分別為2.9kb、3.2kb、4.2kb、5.6kb和3.8kb；

（5）用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，然后將PCR產(chǎn)物進行純化，分別與pMD19-T載體連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克隆；核苷酸序列測定由TaKaRa公司完成，測序完成后，對5個片段進行拼接，即獲得SPCSV基因組近全長序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的方法，其特征在于，在所述步驟（3）中，反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為：3.75?μL?RNA?模板，2μl?5×RT?buffer，0.5μL濃度為10?μmol/L的下游引物，3?μL濃度為2.5?mmol/L?的dNTPs，0.25?μL濃度為40U/μl的RNase抑制劑和0.5?μL濃度為5U/μl的AMV反轉(zhuǎn)錄酶；所述下游引物為RNA1-2989-3'、RNA1-5596-3'、RNA1-8637-3'、RNA2-5599-3'或RNA2-8223-3'；反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序為：42℃反轉(zhuǎn)錄60min，99℃?5min，5℃?5min，反應(yīng)后得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的方法，其特征在于，在所述步驟（4）中，PCR的反應(yīng)體系為50μl，包括：5?μL10×PCR?buffer，4μL濃度為2.5?mmol/L的dNTPs，濃度為10?μmol/L?的引物各1?μL，0.5μL濃度為5U/μL的LA?Taq酶，5?μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，余量為ddH₂O；所述引物為RNA1-1-5'和RNA1-2989-3'，或為RNA1-2420-5'和RNA1-5596-3'，或為RNA1-4410-5'和RNA1-8637-3'，或為RNA2-53-5'?和RNA2-5599-3'，或為RNA2-4440-5'和RNA2-8223-3'；PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5?min；94℃變性30s，54℃退火30s，根據(jù)目的條帶大小，按照1kb/min計算延伸時間，72℃延伸3～6?min，完成35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。