[發明專利]一種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210173705.4
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102707058A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 張利寧;王群;劉香嵐;石永玉;郭春;朱法良;王曉燕;王嘉寧
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/532;G01N1/30
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術領域

本發明涉及一種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，屬于醫學和生物學檢測領域。

背景技術

肺癌是最常見的肺原發性惡性腫瘤，近年來，世界各國特別是工業發達國家，肺癌的發病率和病死率均呈上升趨勢，成為全球癌性死亡中的一個重要因素，被稱為“全球頭號癌癥殺手”。近年來，我國肺癌發病率快速上升，2000年新發病例180-200萬，死亡140-150萬，發病率36.7/10萬，肺癌患者總數居世界第一。肺癌的高死亡率主要是由于肺癌起病隱匿且目前缺乏有效的篩查和早期診斷方法而延誤了最佳治療時機，患者出現癥狀時多為晚期，預后較差。肺癌患者的預后與病變的早晚有明顯的關系，即早期病變通過治療，大多可以獲得長期生存，因此開展肺癌的早期發現、早期診斷和早期治療成為改善肺癌治療效果的希望所在。

近年來，在肺癌的輔助診斷方面，腫瘤標志物的研究十分活躍，目前應用于臨床的肺癌診斷標志物主要有CEA，SCC，CYFRA21?1等，而它們仍有許多局限性：許多腫瘤細胞都能產生CEA，在一些良性腫瘤及非腫瘤疾病中也可見到部分患者有一時性的升高，吸煙者亦可出現假陽性，因其特異性較低，一般多與其他的腫瘤標志物聯合檢測才能提高對肺癌的確診率；SCC和CYFRA21?1都是肺鱗癌較特異的標志物，而在其他類型的肺癌陽性率極低。因此，急需尋找一種對肺癌更敏感和特異性更高的新的腫瘤標志物。

發明內容

TIPE3是最新發現的TIPE家族基因，由于缺乏特異性抗體目前對于該基因的研究還未見報道，我們根據人類TIPE3晶體結構及TIPE家族同源性分析，并結合抗體設計篩查軟件，選擇人TIPE3蛋白特異的片段，制備了兔抗人TIPE3的多克隆抗體。我們利用該TIPE3抗體對肺癌進行免疫組織化學診斷，發現在肺癌的不同病理類型中TIPE3都呈高表達趨勢，而在相應癌旁組織中TIPE3表達降低或缺失。因此，本發明的目的是提供了一種肺癌的TIPE3（肺癌蛋白標志物TNFAIP8L3，即tumor?necrosis?factor-α?induced?protein?8，簡稱Tipe3）免疫組織化學診斷試劑盒，該試劑盒不僅具有高度的免疫反應特異性、敏感性，而且對多種病理類型的肺癌發生都能夠準確的檢測出來。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種用于診斷肺癌的Tipe3免疫組織化學檢測試劑盒，該試劑盒內容物中包括：滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑，阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑，與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體以及抗體稀釋液，能與初始抗體連接的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆連接抗體，能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑，能特異性對組織中細胞核染色的試劑；操作時依次加入各試劑，其用量的體積配比關系為：內源性過氧化物酶和生物素滅活劑∶非特異性蛋白阻斷劑∶初始抗體∶抗體稀釋液∶連接抗體∶顯色試劑∶細胞核染色劑=5～10∶5～10∶0.05～0.1∶5～10∶5～10∶5～20∶5～10。可根據實際使用情況，按上述比例在每盒內分裝20人份、50人份、100人份等劑量的各試劑。

所述滅活人組織切片中內源性過氧化物酶和生物素的試劑為質量濃度為3%的過氧化氫溶液。

所述阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑為山羊血清。

所述與人體組織抗原結合的兔抗人的初始抗體是針對人體肺癌組織中特異性TIPE3抗原所制備的兔抗人特異性TIPE3抗體（該抗體的制備方法為：申請人根據人類TIPE3晶體結構及TIPE家族同源性分析，并結合抗體設計篩查軟件，選擇了人TIPE3蛋白特異的片段：RPNLKRICEGINKLLDEKVL，如序列表中所示，通過常規方法制備了兔抗人TIPE3的多克隆抗體）。

所述抗體稀釋液為含0.1%BSA的磷酸鹽緩沖液（質量體積比，單位g/ml）。

所述用于特異性初始抗體與顯色試劑之間的連接橋梁的連接抗體是由連有辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體組成。

所述能與辣根過氧化物酶反應并顯色的顯色試劑由雙蒸水，A：DAB底物儲存液，B：穩定的過氧化物和C：增色溶液組成的，四者的體積配比關系為：雙蒸水∶A∶B∶C=17∶1∶1∶1。可根據染色片子的數量按該比率配制。顯色試劑的調制：使用顯色試劑前，將顯色緩沖液裝于另一試管，再滴入A、B、C，輕輕上下翻轉數次，混合后備用。

所述能特異性對組織中細胞核染色的試劑為蘇木素。

所述試劑盒用于組織切片免疫組織化學染色診斷的使用方法，步驟如下：