[發明專利]一種酶法制備高活性低分子量肝素的方法

在審

• 申請號: 201210172930.6
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN102660610A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 陳敬華;劉衛超;王敏;王蘊聰;張頔
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P19/18
• 分類號: C12P19/18;C12P19/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種酶法制備高活性低分子量肝素的方法。屬生物醫藥領域。

背景技術

肝素是有己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷鍵交替形成的粘多糖，其分子量在3000-40000Da之間，平均分子量為15000Da；肝素作為抗凝試劑和抗栓試劑已有60多年的歷史。肝素的抗凝血活性主要通過含有3-位硫酸基氨基葡萄糖的戊糖活性中心結合抗凝血酶(AT-Ⅲ)，誘導其發生構象改變，從而先是抗凝血活性。肝素的抗凝血活性包括抗栓活性(anti-factor?Xa)和抗凝活性(anti-factor?Ⅱa)?？鼓钚赃€和甘肅的分子量有關。但是由于肝素具有抗凝血活性，所以大量的使用會引起出血和誘導性血小板減少、骨質疏松等副作用，從而大大的限制了肝素在臨床上的應用。此外，肝素肝素還具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調血脂等方面的生活功能。

低分子量肝素是由肝素通過化學法或酶法降解得到的小分子片段，分子量在3000-8000Da之間，平均分子量約為5000Da。低分子量肝素具有較高的抗栓活性，其抗凝活性則大大降低，表現出抗血栓形成時對凝血系統影響小，因而在臨床中得到廣泛的應用。與未分級肝素相比，低分子量肝素具有分子量小，按體重給藥，藥理學性質穩定，不需住院治療，生物利用度高，副作用小，體內半衰期長等優點。

目前，LMWHs的制備方法(張萬忠，王云山，馬潤宇，蘇志國，生化藥物雜志，2001，22(1)：48-51)主要有化學裂解法和酶降解法。化學降解法是工業上常采用的方法，主要有亞硝酸將揭發、β-消除降解法、過氧化氫降解法、高碘酸、次氯酸、硫酸-氯磺酸和γ-照射法等。但是化學降解法肝素反應劇烈，使得肝素分子中的某些功能基團在反映過程中或多或少被破壞，因而某些生物活性功能在不同程度被破壞。而酶法降解由于反應條件溫和、對環境友好，且便于檢測，成為進年來的研究熱點。美國專利(Nielsen，US5106734，1992)利用控制232nm處吸光值對肝素控制性降解，制備出分子量相對均以的低分子量產品。于廣利等(于廣利，王群，管華詩，徐家敏，Robert?J，Linhardt，青島海洋大學學報，2002，32(2)：231-235)利用肝素酶對牛肺肝素進行控制酶解，得到聚合度2-20的寡糖純品。主要此外研究還表明，肝素的抗凝血活性取決于其戊糖活性中心的數量。戊糖結構中N-，6-O-及3-O-位硫酸基參與結合AT-Ⅲ，與抗凝血活性有關，而2-O-位硫酸基和艾杜糖醛酸的作用尚不清楚(I.Capila，R.J.Linhardt，Angew.Chem.Int.Ed.，2002，41：390-412.)。其中3-O-位硫酸基尤為重要：如果缺少3-O-位硫酸基，噶怒視的抗凝血活性則會降低1000倍以上；相反，增加一個3-O-位硫酸基，則可以將肝素的抗凝血活性提高數倍。肝素由多種生物合成酶在線粒體內合成。合成過程中會涉及多種合成酶，如：2-O-，6-O-，3-O-硫酸基轉移酶(2-OST，6-OST，3-OST)分別對主鏈不同位置上的羥基進行部分硫酸化(U.Lindahl，M.Kusche-Gullberg，L.kJellen，J.Biol.Chem，1998，273：24979-24982.)，其中3-O-位硫酸化由3-OST完成。這些硫酸基轉移酶大多具有多種異構型式，如3-OST就具有六種異構體。其中，3-OST-1和3-OST-5能合成肝素戊糖活性中心?，F有研究表明肝素及低分子量肝素都是3-OST-1和3-OST-5很好的底物(J.Chen，M.B.Duncan，K.Carrick?et.，Glycobiology，2003，13：785-794)。因此，用3-OST-1和3-OST-5對低分子量肝素選擇性修飾，使80％不具有戊糖活性中心的低分子量肝素經過反映后擁有戊糖活性中心，就可以大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的數量，從而提高其抗凝血活性(理論上可以同時提高抗栓和抗凝活性3-5倍)。

發明內容

本發明的目的是提供一種酶法制備高抗凝血活性低分子量肝素的方法