[發(fā)明專利]一種酶法制備高活性低分子量肝素的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210172930.6
• 申請(qǐng)日: 2012-05-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102660610A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳敬華;劉衛(wèi)超;王敏;王蘊(yùn)聰;張頔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P19/18
• 分類號(hào): C12P19/18;C12P19/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種制備高抗凝活性低分子量肝素的方法，是以肝素為底物，用HepI(組氨酸標(biāo)簽肝素酶I)控制性降解肝素，得到低分子量肝素，再采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)再生系統(tǒng)，以肝素生物合成酶3-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶對(duì)其進(jìn)行選擇性修飾，增加抗凝活性中心的數(shù)量，得到高抗凝活性的低分子量肝素。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特點(diǎn)在于：所述組氨酸標(biāo)簽肝素酶I制備方法如下：將重組質(zhì)粒pET-15b-HepI轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，得到可溶性表達(dá)HepI的工程菌，培養(yǎng)工程菌BL21(pET-15b-HepI)，誘導(dǎo)表達(dá)，得到C端攜帶6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的HepI。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特點(diǎn)在于：所述肝素生物合成酶3-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶是攜帶6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特點(diǎn)在于：所述肝素濃度1-100mg/mL，優(yōu)選10-50mg/mL；肝素酶I的用量0.1-10IU/g肝素，優(yōu)選3IU/g肝素；所述用于降解肝素的反應(yīng)液為25mM醋酸銨，25μMCaCl₂，0.25μg/mL?BSA，pH7.4的Digestion?buffer緩沖液，反應(yīng)溫度為10-40℃，優(yōu)選30-40℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特點(diǎn)在于：所述PAPS再生系統(tǒng)中，反應(yīng)液為含1％Triton?X-100，1％BSA，1mM?MgCI₂，1mM?MnCI₂，pH為5.0-8.0的50mM?Tris-HCI緩沖液，PNPS的濃度為0.1-10mM，PAP的濃度為0.1-50uM，AST-Ⅳ的用量為0.1-50mg/mL，優(yōu)選5-10mg/mL；所述方法中，3-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶的用量為0.1-50mg/mg底物，優(yōu)選1-20mg/mL底物，反應(yīng)溫度為10-40℃，優(yōu)選30-40℃，酶促反應(yīng)的時(shí)間為1-20小時(shí)，優(yōu)選5-10小時(shí)。