[發(fā)明專利]腸炎沙門氏菌核酸標準樣品、其建立方法及應用

無效

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• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102719424A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設計）人: 曹際娟;于兵;徐楊;徐君怡
• 申請（專利權(quán)）人: 曹際娟;于兵;徐楊;徐君怡
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12R1/42
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領域，具體涉及腸炎沙門氏菌核酸標準樣品制備、其建立方法及其在檢測腸炎沙門氏菌中的應用。?

背景技術(shù)

食品安全是重大公共衛(wèi)生問題，是制約我國經(jīng)濟發(fā)展的重要因素。而微生物污染造成的食源性疾病，是我國食品安全中最突出的問題。近年來，隨著食品產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整、經(jīng)濟全球化與國際貿(mào)易的迅速發(fā)展，我國食源性疾病的防控面臨一系列新問題和挑戰(zhàn)。?

食品中微生物引起食源性疾病的預防與控制已引起了世界各國關(guān)注，食品中微生物的檢測技術(shù)是預防與控制的關(guān)健的技術(shù)環(huán)節(jié)。目前我國食品中微生物的檢測仍以傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)、血清抗體檢測、和生化特征比較水平為主，不能滿足日益發(fā)展的檢驗檢疫工作的需要。常規(guī)分離培養(yǎng)耗時長，靈敏度低，某些微生物的培養(yǎng)極為困難。隨著2007年《食品中致病菌檢測方法——實時PCR法》（SN/T1870-2007）和《食品中多種致病菌快速檢測方法—PCR法》（SN/T1869-2007）兩項檢驗檢疫行業(yè)標準的發(fā)布實施，以及即將發(fā)布實施的《食品中致病菌檢測方法——DHPLC法》等系列分子生物學檢測國家標準和行業(yè)標準。簡單快速，靈敏度高的PCR、實時熒光PCR技術(shù)，正在食品致病菌檢測領域開始發(fā)揮重要作用。?

由于食品中細菌的特殊性，人們很難獲得細菌分子生物學檢測陽性樣品，加之食品中致病菌分子生物學檢測技術(shù)的研究剛剛起步，而配套的標準樣品的研究工作則起步較晚，制備技術(shù)復雜，樣品定值和不確定度的評估存在很多困難，因而國內(nèi)外食品致病菌核酸標準樣品（定量、定性測試）基本上是一片空白。目前國內(nèi)外沒有適用于食品中致病菌分子生物學檢測用核酸標準樣品，僅有成套分子生物學檢測試劑盒中配備的陽性對照品，價格非常昂貴，也不具備核酸標準樣品的效能，不能適時地滿足檢驗檢疫工作的需要。研究制備新型的食品致病菌核酸標準樣品，對于保證靈敏、特異、快速檢測食品中致病菌，具有十分重要的意義。?

發(fā)明內(nèi)容

為了解決食品中致病菌核酸標準樣品目前國內(nèi)外均處于空白狀況，本發(fā)明主要針對食品中致病菌腸炎沙門氏菌核酸定性和定量檢測項目，研究制備食品中腸炎沙門氏菌核酸標準樣品。通過對致病菌核酸標準樣品的關(guān)鍵制備技術(shù)和保存技術(shù)的研究，并進行定值技術(shù)和定值方式的研究，開展均勻性和穩(wěn)定性研究，并對食品中致病菌核酸標準樣品值的不確定度進行深入細致的研究，最終研制出具有較好的均勻性和穩(wěn)定性的腸炎沙門氏菌核酸標準樣品。開?發(fā)處于世界領先水平，具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的食品中致病菌核酸標準樣品制備技術(shù)；滿足食品安全檢測的需求，滿足國內(nèi)外食品微生物檢測實驗室的需求。?

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)ATCC：13076的菌株培養(yǎng)、鑒定、核酸標準樣品的制備、核酸標準樣品的干燥、均勻性和穩(wěn)定性檢查、定性檢定、核酸標準樣品定值等項工作。取制備的核酸標準樣品，經(jīng)采用實時PCR方法和PCR方法定性分析，確認所制備的核酸標準樣品為腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)ATCC：13076核酸樣品。采用PicoGreen?DNA分子熒光定量方法及紫外分光光度法，隨機抽取樣品進行測試，數(shù)據(jù)進行T檢驗和F檢驗確認樣品均勻性。經(jīng)Grubbs檢驗和Cochran檢驗，所有數(shù)據(jù)均可作為定值依據(jù)；經(jīng)正態(tài)性檢驗，這些數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。制備的核酸樣品經(jīng)過了四年的穩(wěn)定性測定，在避光、密封，-20℃以下溫度貯存，四年內(nèi)穩(wěn)定。?

本發(fā)明的一方面在于：一種腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)的標準樣品，其制備方法的步驟如下：?

（一）基因組核酸的提取?

①腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)ATCC：13076經(jīng)菌株活化、增菌培養(yǎng)；?

②將步驟①獲得的增菌培養(yǎng)液于4000g，4℃離心15min；?

③吸棄上清，取沉淀1~3mL，加pH8.0的TE溶液10mL懸浮，加0.5mL濃度為100g/L?SDS和50μL濃度為20mg/mL的蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h；?

④加2mL濃度為5mol/LNaCl，混勻，加1.5mL?CTAB-NaCl混合溶液，混勻，65℃溫浴20min；其中，CTAB-NaCl混合溶液為100g/L?CTAB和0.7mol/L?NaCl；?

⑤取上清，加與上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心10min；其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚∶氯仿∶異戊醇的體積比為25∶24∶1；?