[發明專利]腸炎沙門氏菌核酸標準樣品、其建立方法及應用

無效

• 申請號: 201210172206.3
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102719424A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 曹際娟;于兵;徐楊;徐君怡
• 申請（專利權）人: 曹際娟;于兵;徐楊;徐君怡
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12R1/42
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生

1.一種腸炎沙門氏菌標準樣品，其特征在于：通過以下方法制備：

I.基因組核酸的提取

①腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)ATCC：13076，經菌株活化、增菌培養；

②將步驟①獲得的增菌培養液于4000g，4℃離心15min；

③吸棄上清，取沉淀1~3mL，加pH8.0的TE溶液10mL懸浮，加0.5mL濃度為100g/L?SDS和50μL濃度為20mg/mL的蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h；

④加2mL濃度為5mol/L?NaCl，混勻，加1.5mL?CTAB-NaCl混合溶液，混勻，65℃溫浴20min；其中，CTAB-NaCl混合溶液為100g/L?CTAB和0.7mol/L?NaCl；

⑤取上清，加與上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心10min；其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚∶氯仿∶異戊醇的體積比為25∶24∶1；

⑥取上清，加與上清等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心10min；其中，氯仿-異戊醇混合液中氯仿∶異戊醇的體積比為24∶1；

⑦取上清，加上清0.6倍體積的異丙醇，混勻，13000g離心10min；

⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL?pH8.0的TE溶液溶解，獲得腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)ATCC：13076基因組核酸溶液；

⑨紫外分光光度計測步驟⑧所得產物的260nm和280nm處的光密度值，當OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之間時，分裝核酸樣品并進行冷凍干燥；

Ⅱ.冷凍干燥

①樣品預凍：先把步驟Ⅰ所得的核酸樣品在-80℃低溫冷凍2h；

②冷凍過程：干燥室制冷，溫度降至-35℃時開啟冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至-40℃時，將預凍的核酸樣品迅速放入干燥室內，關好干燥室門；啟動真空泵開始抽真空；待真空度降至0.5Torr時，結束冷凍過程；

③樣品干燥：干燥室溫度設置為15℃，當真空度降至0.1Torr時，關閉真空泵，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋獲得腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)ATCC：13076基因組核酸標準樣品，置于-20℃中避光貯存。

2.一種非應用于疾病診斷目的的腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)的檢測試劑盒，其特征在于，包括腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)檢測基因和陽性標準對照品，

Ⅰ.腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)檢測基因，至少包括下述a或b中的一種：

a:腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)中的特異片段invA基因PCR引物：

正向引物：SEQ?ID?NO：1

反向引物：SEQ?ID?NO：2

b:腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)中的特異片段的Real-Time?PCR引物和探針序列：

正向引物：SEQ?ID?NO：3

反向引物：SEQ?ID?NO：4

探針：SEQ?ID?NO：5

Ⅱ.所述的陽性標準對照品是權利要求1所述的腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)標準樣品。