[發(fā)明專利]一種采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210172015.7
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102703391A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙立民;周慶豐;宋延華;蔣天華;羅乃杰
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;C12N5/07
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 劉小敏;馬赟齋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒大規(guī)模擴(kuò)增的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒(Porcine?circovirus，PCV)按照血清型可分為豬圓環(huán)病毒Ⅰ型(簡稱PCV1)和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(簡稱PCV2)兩種，其中PCV1不具致病性，但能產(chǎn)生血清抗體，PCV2則能對豬只具有較強的易感性，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬呼吸疾病綜合征(PRDC)、豬皮膚和腎病綜合征(PDNS)?等多種疾病的主要病原，PCV有7個開放閱讀框(ORF)，其中ORF2編碼病毒的Cap蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼。PCV1和PCV2的Cap蛋白上存在共同的抗原決定簇，但兩者之間沒有抗原交叉性，所以通常采用致病性PCV2的ORF2替代PCV1的ORF2，構(gòu)建嵌合型豬圓環(huán)病毒PCV1-2，用于防治斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥。然而PCV是一種DNA病毒，病毒變異率低，生物學(xué)特性比較特殊，它在細(xì)胞上增殖滴度很低，且不引起細(xì)胞病變，在研制滅活疫苗和弱毒疫苗的難度很大。

目前，國內(nèi)的豬圓環(huán)病毒疫苗大部分依靠傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法工藝生產(chǎn)，少量依靠微載體懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)。其中，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法是將細(xì)胞種從液氮罐中取出來，用培養(yǎng)瓶復(fù)蘇，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，分傳成幾個培養(yǎng)瓶，依次類推，待培養(yǎng)瓶數(shù)量夠多時，用胰蛋白酶消化，將消化好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)瓶中生長。細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶上長滿后，再用胰蛋白酶消化，分傳成幾個轉(zhuǎn)瓶，這些轉(zhuǎn)瓶可以再傳代為多個轉(zhuǎn)瓶，或者接種病毒，接毒后的轉(zhuǎn)瓶經(jīng)過一段時間后收獲病毒。為了提高病毒侵染效率，在接種病毒的同時會添加主要成分為氨基葡萄糖的孵育劑，促進(jìn)病毒對細(xì)胞的侵染，以縮短病毒培養(yǎng)時間。這種工藝過程簡單，可以通過不斷地細(xì)胞傳代，可規(guī)模性地復(fù)制放大，但是需要不斷地分傳，操作繁瑣，生產(chǎn)勞動強度大，效率低。而使用的培養(yǎng)瓶和轉(zhuǎn)瓶多，占地多，耗能大，在分傳時易污染，病毒毒價低，生產(chǎn)的疫苗不同批次間差異明顯，所獲得的病毒液中細(xì)胞碎片、蛋白等雜質(zhì)較多，后期處理工藝復(fù)雜，容易導(dǎo)致疫苗質(zhì)量穩(wěn)定性差。

微載體懸浮培養(yǎng)工藝是近年來新興的細(xì)胞生產(chǎn)方式，是在培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中加入對細(xì)胞無害的微載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長，同時在培養(yǎng)過程中通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)，使細(xì)胞能夠與之充分接觸。雖然與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法工藝相比，占地少，耗能小，用人少，生產(chǎn)規(guī)模更容易擴(kuò)大，病毒毒價較高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，但是其生產(chǎn)工藝存在以下問題：①?存在細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性問題，細(xì)胞種接種不易均勻；②?病毒接種時需排空細(xì)胞生長液，在換液時會損失微載體；③?微載體顆粒小，難以將其孔隙內(nèi)的細(xì)胞碎片等雜質(zhì)清洗干凈，因此不能回收利用，只能一次性使用，而微載體價格昂貴，造成生產(chǎn)成本高；④?細(xì)胞在微載體上的生長狀態(tài)為伸展形態(tài)，接近平面結(jié)構(gòu)，接種病毒后，細(xì)胞死亡過程是同步的，即絕大多數(shù)的細(xì)胞死亡時間接近，而且為了提高病毒侵染效率，在細(xì)胞培養(yǎng)液中需要添加主要成分為氨基葡萄糖的孵育劑，促進(jìn)病毒對細(xì)胞的侵染，因此僅能一次性收獲病毒。例如40L反應(yīng)器應(yīng)用微載體懸浮培養(yǎng)工藝只能收獲30到40L的病毒液，沒有達(dá)到反應(yīng)器灌注工藝的最大生產(chǎn)效率，收獲的病毒液體積少，致使生產(chǎn)成本較高。

在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝和微載體懸浮培養(yǎng)工藝中，在宿主細(xì)胞培養(yǎng)好后，需要用無菌PBS溶液清洗宿主細(xì)胞1至2遍，排出PBS溶液后再補加細(xì)胞維持液。其目的是清除殘余血清、細(xì)胞碎片、蛋白等雜質(zhì)，但是這一過程對于宿主細(xì)胞有損害作用，并會殘留少量PBS溶液，由于該溶液只有清洗作用，非宿主細(xì)胞生長代謝的必須物，它的存在會影響細(xì)胞維持液的濃度，直接影響到細(xì)胞生產(chǎn)病毒的效率。