[發明專利]一種采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法

有效

• 申請號: 201210172015.7
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102703391A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 趙立民;周慶豐;宋延華;蔣天華;羅乃杰
• 申請（專利權）人: 廣東溫氏食品集團有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;C12N5/07
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 劉小敏;馬赟齋

1.一種采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)?宿主細胞種的制備

采用常規細胞培養方法培養宿主細胞；

(2)?籃式反應器接種前的準備

在籃式反應器的載體籃內裝入籃式反應器專用的Fibra?Disk載體，加入PBS溶液，使載體能夠全部浸泡在該PBS溶液液中，做滅菌處理；

(3)?宿主細胞擴大培養

在向所述反應器內接種步驟(1)所得宿主細胞前，排出反應器內的PBS溶液，加入細胞生長液，先按宿主細胞擴大培養的條件設定好籃式反應器的各項參數，包括溫度、溶解氧(DO)、PH和攪拌速率，直到各參數穩定后，再將步驟(1)所得宿主細胞接種至籃式反應器內，讓宿主細胞在浸泡于細胞生長液中的Fibra?Disk載體上吸附生長，當培養至細胞耗糖量穩定時，接種病毒；

(4)?病毒增殖培養

將所述反應器內的細胞生長液排空，補充與排出的細胞生長液等體積的細胞維持液后，接種豬圓環病毒，接毒后36~48h，進行第一次收取病毒液，在收獲病毒液后，再向反應器內加入與已收取的病毒液等體積的細胞維持液，對病毒再次進行繁殖復制并收獲，如此循環反復多次，直至檢測到要收獲的病毒液中的細胞耗糖量降至0.5g/L/天以下時，收獲本批次最后一次豬圓環病毒液。

2.根據權利要求1所述的采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法，其特征在于，所述步驟(4)中自第一次收取豬圓環病毒液起，每間隔8~12小時收取一次豬圓環病毒液。

3.根據權利要求1或2所述的采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法，其特征在于，所述步驟(4)的細胞維持液由RPMI-1640培養基液和牛血清組成，其中，RPMI-1640培養基液的體積分數為98%~99.5%，牛血清的體積分數為0.5%~2%。

4.根據權利要求3所述的采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法，其特征在于，所述步驟(4)的病毒增殖培養的條件：PH：7.2~7.5，溶解氧：50%~80%，攪拌槳轉速：60~90?RPM，溫度：33℃~37℃。

5.根據權利要求4所述的采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)的宿主細胞按照每克載體接種1~5×10⁶cells的密度接種于籃式反應器內，所述籃式反應器中每1L的有效體積中裝填25~40g載體，而加入的細胞生長液沒過籃式反應器中的攪拌槳的槳葉。

6.根據權利要求5所述的采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中宿主細胞在籃式反應器內培養5~7天，細胞耗糖量穩定在1~1.5g/L/天或1.5g/L/天以上，此時的宿主細胞應用于病毒培養。

7.根據權利要求6所述的采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，定時取反應器中的培養液樣品，測定細胞耗糖量，當連續幾次測定的細胞耗糖量的數值都趨于接近時，確定細胞耗糖量已穩定。

8.根據權利要求7所述的采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的細胞生長液由RPMI-1640培養基液和牛血清組成，其中，RPMI-1640培養基液93%~97%，牛血清3%~7%；所述宿主細胞擴大培養的條件為：PH：7.0~7.3，溶解氧：50%~80%，攪拌槳轉速：50~100?RPM，溫度：37℃；所述的消毒滅菌處理的具體操作為：在120~125℃的溫度下滅菌30~50min。

9.根據權利要求8所述的采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)所述的宿主細胞采用灌注培養方式進行擴大培養。

10.根據權利要求9所述的采用籃式反應器發酵制備豬圓環病毒的方法，其特征在于，所述的宿主細胞為PK-15細胞。