[發(fā)明專利]一種采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210172015.7
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102703391A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙立民;周慶豐;宋延華;蔣天華;羅乃杰
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;C12N5/07
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 劉小敏;馬赟齋

1.一種采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)?宿主細(xì)胞種的制備

采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)宿主細(xì)胞；

(2)?籃式反應(yīng)器接種前的準(zhǔn)備

在籃式反應(yīng)器的載體籃內(nèi)裝入籃式反應(yīng)器專用的Fibra?Disk載體，加入PBS溶液，使載體能夠全部浸泡在該P(yáng)BS溶液液中，做滅菌處理；

(3)?宿主細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)

在向所述反應(yīng)器內(nèi)接種步驟(1)所得宿主細(xì)胞前，排出反應(yīng)器內(nèi)的PBS溶液，加入細(xì)胞生長液，先按宿主細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的條件設(shè)定好籃式反應(yīng)器的各項參數(shù)，包括溫度、溶解氧(DO)、PH和攪拌速率，直到各參數(shù)穩(wěn)定后，再將步驟(1)所得宿主細(xì)胞接種至籃式反應(yīng)器內(nèi)，讓宿主細(xì)胞在浸泡于細(xì)胞生長液中的Fibra?Disk載體上吸附生長，當(dāng)培養(yǎng)至細(xì)胞耗糖量穩(wěn)定時，接種病毒；

(4)?病毒增殖培養(yǎng)

將所述反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞生長液排空，補(bǔ)充與排出的細(xì)胞生長液等體積的細(xì)胞維持液后，接種豬圓環(huán)病毒，接毒后36~48h，進(jìn)行第一次收取病毒液，在收獲病毒液后，再向反應(yīng)器內(nèi)加入與已收取的病毒液等體積的細(xì)胞維持液，對病毒再次進(jìn)行繁殖復(fù)制并收獲，如此循環(huán)反復(fù)多次，直至檢測到要收獲的病毒液中的細(xì)胞耗糖量降至0.5g/L/天以下時，收獲本批次最后一次豬圓環(huán)病毒液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法，其特征在于，所述步驟(4)中自第一次收取豬圓環(huán)病毒液起，每間隔8~12小時收取一次豬圓環(huán)病毒液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法，其特征在于，所述步驟(4)的細(xì)胞維持液由RPMI-1640培養(yǎng)基液和牛血清組成，其中，RPMI-1640培養(yǎng)基液的體積分?jǐn)?shù)為98%~99.5%，牛血清的體積分?jǐn)?shù)為0.5%~2%。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法，其特征在于，所述步驟(4)的病毒增殖培養(yǎng)的條件：PH：7.2~7.5，溶解氧：50%~80%，攪拌槳轉(zhuǎn)速：60~90?RPM，溫度：33℃~37℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)的宿主細(xì)胞按照每克載體接種1~5×10⁶cells的密度接種于籃式反應(yīng)器內(nèi)，所述籃式反應(yīng)器中每1L的有效體積中裝填25~40g載體，而加入的細(xì)胞生長液沒過籃式反應(yīng)器中的攪拌槳的槳葉。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中宿主細(xì)胞在籃式反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)5~7天，細(xì)胞耗糖量穩(wěn)定在1~1.5g/L/天或1.5g/L/天以上，此時的宿主細(xì)胞應(yīng)用于病毒培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，定時取反應(yīng)器中的培養(yǎng)液樣品，測定細(xì)胞耗糖量，當(dāng)連續(xù)幾次測定的細(xì)胞耗糖量的數(shù)值都趨于接近時，確定細(xì)胞耗糖量已穩(wěn)定。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的細(xì)胞生長液由RPMI-1640培養(yǎng)基液和牛血清組成，其中，RPMI-1640培養(yǎng)基液93%~97%，牛血清3%~7%；所述宿主細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的條件為：PH：7.0~7.3，溶解氧：50%~80%，攪拌槳轉(zhuǎn)速：50~100?RPM，溫度：37℃；所述的消毒滅菌處理的具體操作為：在120~125℃的溫度下滅菌30~50min。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法，其特征在于，所述步驟(3)所述的宿主細(xì)胞采用灌注培養(yǎng)方式進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的采用籃式反應(yīng)器發(fā)酵制備豬圓環(huán)病毒的方法，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為PK-15細(xì)胞。