[發(fā)明專利]一種活動(dòng)性肺結(jié)核病特異的血清miRNAs的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210171919.8
• 申請(qǐng)日: 2012-05-30
• 公開（公告）號(hào): CN102732520A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李繼承;張星
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/10;C12Q1/68
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是制備活動(dòng)性肺結(jié)核病特異(標(biāo)志性)的血清miRNAs的方法。

背景技術(shù)

全世界有20億人感染了結(jié)核分枝桿菌，2000萬(wàn)人患肺結(jié)核病，其中活動(dòng)性肺結(jié)核病1200萬(wàn)例，每年新增肺結(jié)核病(pulmonary?tuberculosis，TB)患者850～920萬(wàn)例，死亡率達(dá)120～150萬(wàn)例，是單一感染因素引起死亡人數(shù)最多的疾病。在世界上22個(gè)肺結(jié)核病最嚴(yán)重國(guó)家中，我國(guó)位列第2位，流行形勢(shì)十分嚴(yán)峻。我國(guó)現(xiàn)有肺結(jié)核病患者451萬(wàn)人，其中活動(dòng)性肺結(jié)核病患者約130萬(wàn)人，新發(fā)病例145萬(wàn)例/年，死亡率達(dá)13萬(wàn)例/年，超過(guò)了其他傳染病死亡人數(shù)的總和?；顒?dòng)性肺結(jié)核病的研究難點(diǎn)是缺乏特異的標(biāo)志物。研究資料表明，血清和血漿中存在穩(wěn)定性的miRNAs，并且miRNAs表達(dá)譜的變化具有組織和細(xì)胞特異性，適合作為肺結(jié)核病的候選生物學(xué)標(biāo)記物。

但是由于miRNAs分子量小，血清中含量少，但數(shù)量巨大，傳統(tǒng)的測(cè)序法操作復(fù)雜，費(fèi)用貴，測(cè)序深度有限，效率較低，不適于miRNAs的檢測(cè)。所以，miRNAs的檢測(cè)和分析就成了關(guān)鍵問(wèn)題。隨著高通量測(cè)序篩查技術(shù)的發(fā)展，miRNAs的研究得到了極大提高。該測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)17-35個(gè)核苷酸內(nèi)的任何RNA，基于所測(cè)目標(biāo)miRNAs的標(biāo)簽序列和出現(xiàn)頻率，可以用于發(fā)現(xiàn)新的miRNAs及檢測(cè)已知miRNAs長(zhǎng)度和序列的微小改變。并可根據(jù)需求調(diào)整提取范圍，具有速度快、成本低、覆蓋度深等優(yōu)點(diǎn)，非常適合21-25個(gè)核苷酸組成的miRNAs的測(cè)序，可獲得數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的miRNAs，還能發(fā)現(xiàn)新的miRNAs，準(zhǔn)確度和靈敏度高。同時(shí)，用于發(fā)掘、鑒定并定量所有物種全基因組水平的miRNAs圖譜，是解密miRNAs圖譜的較好方法。目前尚無(wú)應(yīng)用高通量測(cè)序篩查肺結(jié)核差異表達(dá)的血清miRNAs的報(bào)道。經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序篩查的差異表達(dá)miRNAs，還需熒光定量PCR驗(yàn)證。由于成熟的miRNAs長(zhǎng)度太短，不能通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，但通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，配合實(shí)時(shí)定量PCR引物及探針，可以精確檢測(cè)微量樣品中miRNAs表達(dá)。miRNAs熒光定量PCR技術(shù)是一種新的檢測(cè)技術(shù)，可以對(duì)成熟miRNAs進(jìn)行定量，有效區(qū)分成熟miRNAs分子和前體分子以及其它成熟miRNAs的同源分子，具有快速、簡(jiǎn)單、省時(shí)、檢測(cè)靈敏度高，樣品消耗少(僅需1-10ng的總RNA或50pg左右的miRNAs)，超寬的線性范圍，可跨越7個(gè)數(shù)量級(jí)，是非常適合的制備差異表達(dá)的miRNAs。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所有解決的技術(shù)問(wèn)題是提供制備活動(dòng)性肺結(jié)核病特異的血清miRNAs的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種活動(dòng)性肺結(jié)核病特異的血清miRNAs的制備方法，包括以下步驟：A1：活動(dòng)性肺結(jié)核病患者和健康對(duì)照者血清樣本的采集和臨床檢測(cè)；A2：提取血清樣本的總RNA；A3：活動(dòng)性肺結(jié)核病特異的血清miRNAs的高通量測(cè)序篩查；A4：設(shè)計(jì)miRNAs莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物以及上游、下游引物，莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物為SEQ?ID?NO：10-SEQ?ID?NO：18，通用的上游引物為SEQ?ID?NO：19，下游引物為SEQ?ID?NO：20-SEQ?ID?NO：28；A5：熒光定量PCR驗(yàn)證活動(dòng)性肺結(jié)核病特異的血清miRNAs。

所述的方法，所述A1具體執(zhí)行以下操作：收集80例活動(dòng)性肺結(jié)核患者和80例健康對(duì)照者。所有參加者血樣為晨起空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，采集外周血3.0mL，4個(gè)小時(shí)以內(nèi)離心(3000x?g，10min，4℃)，吸上清后分裝成各200μL，保存于-80℃冰箱。