[發明專利]一種活動性肺結核病特異的血清miRNAs的制備方法

有效

• 申請號: 201210171919.8
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN102732520A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 李繼承;張星
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種活動性肺結核病特異的血清miRNAs的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：A1：活動性肺結核病患者和健康對照者血清樣本的采集和臨床檢測；A2：提取血清樣本的總RNA；A3：活動性肺結核病特異的血清miRNAs的高通量測序篩查；A4：設計miRNAs莖環反轉錄引物以及上游、下游引物，莖環反轉錄引物為SEQ?ID?NO：10-SEQ?ID?NO：18，通用的上游引物為SEQ?ID?NO：19，下游引物為SEQ?ID?NO：20-SEQ?ID?NO：28；A5：熒光定量PCR驗證活動性肺結核病特異的血清miRNAs。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述A1具體執行以下操作：收集80例活動性肺結核患者和80例健康對照者。所有參加者血樣為晨起空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，采集外周血3.0mL，4個小時以內離心：3000x?g，10min，4℃；吸上清后分裝成各200μL，保存于-80℃冰箱。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述A2具體執行以下操作：將活動性肺結核病患者和健康對照者血清于-80℃中取出，待4℃自然溶解；用移液器吸取200μL，加入到1.5ml無RNase?EP管中，加入700μL?Qiagen?Lysis?solution，置于渦旋儀劇烈渦旋混勻至充分裂解，直到看不到白色懸浮物；室溫靜置5min；加140μL氯仿；劇烈混合15s，靜置分層3min；看到有分層現象時12000g，15min，4℃；用移液器取上清液體轉移到新的1.5mL收集管中，加1.5倍上清體積的無水乙醇，上下顛倒混勻；取700μL含乙醇的裂解液加到柱子中，8000g離心18s，棄下層，重置收集管于柱上，重復2次；加入700μLRWT?solution，8000g離心18s，棄下層，將柱置于一新的收集管上；加入500μL?RPE，8000g離心18s，棄下層，重置收集管于柱上；加入500μL?RPE，8000g離心2min，棄收集管。把柱子放入新的2ml收集管中，全速離心1min；把柱子放入1.5mL?Elution管中；加入30μL?RNase-Free?Water，靜置1min，使溶液充分與柱結合，然后8000g離心1min，重復2次。

取活動性肺結核病患者和健康對照者血清總RNA樣本1.0μL，經nanodrop-2000檢測OD值，在紫外分光光度計上測定A260/A280數值，當其數值在1.8～2.0之間表示總RNA的純度較好；小于1.8說明溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，而大于2.0則可能總RNA已降解；而A260/A230，則比值應在2～2.5之間，偏小則說明有殘余鹽剩余。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述A3具體執行以下操作：用高通量測序篩查技術，初步篩選活動性肺結核病患者和健康對照者之間差異表達的血清miRNAs；20例肺結核病患者和20例健康對照者各提供5mL的血清；血清要求：經Agilent?Bioanalyzer檢測后濃度≥5ng/ul，總量≥100ng；蛋白、鹽離子等雜質少，PAGE膠電泳分離比較正常；根據結果和生物信息學軟件分析，如歸一化和差異分析計算方法挑選差異表達miRNAs；通過聚類方法包括層次聚類，Kmeans聚類及SOM等對不同的樣本進行分類，并對差異miRNAs進行相似性分析，得到差異表達的血清miRNAs。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述A3具體執行以下操作：根據高通量測序篩查技術得到的初步結果，篩選出9個miRNAs：hsa-let-7i，hsa-miR-122，hsa-miR-146a，hsa-miR-146b-5p，hsa-miR-181a-2*，hsa-miR-320c，hsa-miR-378，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-93。