[發(fā)明專利]一種亞鐵螯合抗菌肽制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210171376.X
• 申請(qǐng)日: 2012-05-11
• 公開（公告）號(hào): CN103388014A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧尚貴;林慧敏;張賓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江海洋學(xué)院
• 主分類號(hào): C12P21/06
• 分類號(hào): C12P21/06;C07K1/20;C07K1/16
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種亞鐵螯合抗菌肽的制備方法，特別是關(guān)于一種帶魚蛋白酶解亞鐵螯合抗菌肽的制作方法。

背景技術(shù)

帶魚是我國(guó)最主要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類之一，帶魚營(yíng)養(yǎng)豐富味道鮮美，除直接食用外還可以加工成罐頭、即食食品等，但是在加工過(guò)程中帶魚的魚頭、魚骨、內(nèi)臟等會(huì)棄之不用，這部分約占帶魚重量的一半以上。目前對(duì)這些腳料的利用多集中于生產(chǎn)動(dòng)物飼料、制作魚露、水解蛋白等，但這些下腳料中含有豐富不飽和脂肪酸及優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源，這樣的處理方法不僅浪費(fèi)優(yōu)質(zhì)蛋白資源，且生產(chǎn)成本高，若隨意的處理也會(huì)造成環(huán)境的污染。

富含鐵元素的食物如動(dòng)物肝臟中的鐵均為三價(jià)鐵，三價(jià)鐵是不能為人體所吸收的，必須在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為二價(jià)鐵之后，人體才能夠吸收利用。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，缺鐵性貧血已成為一種威脅人類健康的全球性疾病。目前使用的補(bǔ)鐵制劑有兩種，化學(xué)合成的補(bǔ)鐵制劑和生物制劑，前者副作用大，而后者價(jià)格昂貴。天然蛋白質(zhì)經(jīng)水解后可以生成不同大小的小肽和氨基酸，小肽和游離氨基酸與微量元素結(jié)合形成的小分子絡(luò)合物，這些小分子螯合物可通過(guò)小腸粘膜上皮細(xì)胞直接被機(jī)體吸收。近年來(lái)關(guān)于蛋白水解產(chǎn)物小肽及游離氨基酸與鐵離子結(jié)合能力評(píng)價(jià)及促進(jìn)鐵元素吸收等方面的研究已受到普遍關(guān)注。在前人的科學(xué)研究中還發(fā)現(xiàn)亞鐵螯合肽具有明顯的抗菌抗氧化作用。因此，利用帶魚下腳料蛋白制備有抗菌抗氧化功效的功能性食品或食品配料，既可為帶魚等富含蛋白質(zhì)的海洋低值魚資源的深度開發(fā)和利用提供理論依據(jù)，也為實(shí)現(xiàn)帶魚資源的綜合利用、提高其附加值開辟新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽的制備方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明包括以下步驟：

1)將帶魚下腳料加入蒸餾水，然后加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，調(diào)整酶解液的pH為5.5～6.5，酶解8～10h后滅酶，離心，去除沉淀；

2)將氯化亞鐵加入到所述酶解液中，螯合溫度為30～50℃，震蕩螯合30～60min，離心，去沉淀，成為帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽的粗提物。

對(duì)所述粗提物進(jìn)行一下純化步驟，可得到純化的帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽：

1)真空濃縮、冷凍干燥所述帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽的粗提物，并將所述粗提物分級(jí)超濾，抗菌活性高的超濾組分經(jīng)葡聚糖凝膠層析洗脫分離，有抗菌活性的層析組分再經(jīng)反向高效液相色譜洗脫，收集洗脫液；

2)對(duì)所述洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥，成為帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽。

在上述過(guò)程中，所述帶魚下腳料與木瓜蛋白酶的重量份數(shù)比為100∶2～5；所述木瓜蛋白酶酶解溫度為30～50℃，酶解時(shí)間為8～10h；滅酶溫度為90～100℃，滅酶時(shí)間為10～20min。

亞鐵螯合過(guò)程中，所述氯化亞鐵與酶解液體積份數(shù)之比為1～30∶40(mg∶mL)；螯合溫度為30～50℃，震蕩螯合30～60min。

真空濃縮帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽粗提物的溫度為30～50℃，濃縮時(shí)間為6～8h；冷凍干燥溫度為-60～-70℃，冷凍時(shí)間為24～36h。

葡聚糖凝膠層析柱為Sephadex?G25，所述洗脫液為pH?6.8，0.1mol/L的磷酸緩沖液，洗脫速度為18mL/h。

反向高效液相色譜為XBrige^TMPrep-C18；冷凍干燥溫度為-60～-70℃，冷凍時(shí)間為24～36h。

本發(fā)明研究了帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽的分離純化技術(shù)，并對(duì)分離純化的亞鐵螯合抗菌肽的活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.20mg/ml，最小殺菌濃度為0.26mg/ml，掃描電鏡結(jié)果表明：帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽主要作用金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，原本清晰可見的細(xì)胞之間的界限變模糊，菌體細(xì)胞粘結(jié)在一起，結(jié)成團(tuán)塊狀；單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯的模糊、粗糙區(qū)域。說(shuō)明帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌是通過(guò)破壞細(xì)胞膜、抑制細(xì)菌菌體分裂達(dá)到殺菌作用的。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了制備具有較強(qiáng)抗菌活性的帶魚酶解蛋白亞鐵螯合抗菌肽，為生產(chǎn)抗菌肽提供了一個(gè)新的途徑和方法。2、采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗菌肽，屬于天然提取物，具有天然、無(wú)毒、無(wú)污染、高效抗菌等特點(diǎn)，是一種新型的綠色抗微生物物質(zhì)。3、本發(fā)明操作方便、分離提取率高。4、實(shí)施本發(fā)明方法的原料帶魚下腳料豐富，可以滿足大規(guī)模深加工的需要。5、本發(fā)明可以使帶魚加工廢棄物得到高值化利用，因此本發(fā)明具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

附圖說(shuō)明