[發明專利]一種米曲霉分泌制備錳過氧化物酶的方法

有效

• 申請號: 201210169836.5
• 申請日: 2012-05-29
• 公開（公告）號: CN103451162A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 張志才;陳鈞;任曉鋒;李佳少;黃達明
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12R1/69
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

????本發明涉及生物工程領域，特指未經高溫、高壓處理的秸稈培養基經發酵制備錳過氧化物酶制品，該制品用水提取，提取液經過分子截留，冷凍干燥獲得錳過氧化物酶的粗品。

背景技術

我國是農業大國，每年農作物秸稈年產量逾6億噸，除少量被用作紡織、造紙行業，但大部分以堆積、焚燒的形式傾入環境，既浪費了資源也給環境造成了極大地危害。

秸稈含有植物光合作用所積累的一半以上的能量，富含粗糖、粗蛋白質等有利于家畜家禽所需的成分，作為非競爭性的飼料資源，只要能夠進行合理的加工調制，用來飼喂畜禽，特別是用來飼喂牛、羊等反芻家畜，有可能成為優質的飼料資源。同時，我國又是一個飼料(尤其是蛋白質飼料)嚴重短缺的大國，每年需進口大量的魚粉以彌補蛋白質飼料的不足。所以能否將秸稈纖維轉化為動物可利用且營養價值高的蛋白質飼料，以解決飼料需求的嚴重不足，就顯得尤為重要。

植物的秸稈主要有木質素和纖維素構成。木質素是一類由苯酚和非苯酚結構單元通過醚鍵和碳碳鍵等連接而成的具有芳香族特性的天然聚合物，其在組分種類和連接鍵類型方面的多樣性，意味著其結構的異質性與不規則性，也決定了對木質素進行生物降解的復雜性和特殊性，且其在植物細胞壁中與半纖維素以共價鍵形式結合后，將纖維素分子包埋在其中，形成堅固的天然屏障，使一般的微生物很難進入其中分解纖維素，因此，木質素的降解也是能否有效利用秸稈資源的關鍵因素。

目前降解秸稈的主要方法中有代表性的包括蒸汽汽爆預處理、硫酸預處理、氫氧化鈉預處理、氨水預處理和生物預處理等5種方法。蒸汽汽爆則是以高壓蒸汽滲入纖維內部，以氣流的方式從封閉的空隙中釋放出來，纖維發生一定的機械斷裂，使原料中大部分半纖維素和少量木質素、纖維素降解溶出，該方法成分較高，需要大型的設備，木質素還需要處理；酸處理法是利用硫酸水解糖苷鍵、酯鍵等，使玉米秸稈纖維的網狀結構疏松，但是該方法耗用大量的有機酸或無機酸，木質素仍需要進一步處理，不適應大規模的工業化生產。堿處理和氨水處理是利用木質素溶于堿性溶液，與酸處理一樣同樣存在環境污染問題。這些方法普遍都存在反應條件較難掌握、反應溫度高、處理時間長、占用空間大、處理效果不理想,不能去除木質纖維素等問題，近年來生物處理秸稈越來越受到人們的重視，生物降解木質素的關鍵是微生物能夠分泌降解木質素的酶：錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶。

目前，已有不少專利涉及微生物分泌錳過氧化物酶，如專利（申請號/專利號:200810064332）介紹了強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶方法，此方法比現有的白腐真菌發酵錳過氧化物酶的方法提前了三天，發酵周期縮短了一半，酶產量高于900U/L；專利（申請號：200680022879）目標是增加白腐擔子菌生產胞外漆酶和錳過氧化物酶的產量，并降低成本，此方法相對于現有培養技術，可使漆酶和錳過氧化物酶產量顯著增加；專利（申請號：200910079781）介紹了另一種錳過氧化物酶產生菌——哈茨木霉，該菌可在短期內（4-5天）形成大量分生孢子，其形成分生孢子的速度比黃孢原毛平革菌快約一周時間，且產孢子能力可以達到黃孢原毛平革菌的10倍，而黃孢原毛平革菌則是擔子菌中生長和產孢子能力較強的菌種。米曲霉是被美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協會(AAFCO)、?我國農業部認定的可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種，但是未見米曲霉分泌錳過氧化物酶的專利及其相關文獻報道。

本發明人經過深入的研究，摸索出一種以秸稈為主要原料，通過米曲霉菌體固體培養獲得錳過氧化物酶的方法。該方法與過去的方法不同之處在于所使用的菌種是被美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協會(AAFCO)、?我國農業部認定的可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑的米曲霉菌種，采用秸稈作為主要原料，通過固態發酵獲得含有錳過氧化物酶的發酵物制品，該制品可以經過進一步提取制得錳過氧化物酶粗品。

發明內容

本發明一個目的是提供了一種以米曲霉為菌種，以秸稈為原料進行固態發酵的方法，以及由該方法制備的米曲霉發酵物，該發酵物中含有錳過氧化物酶。

本發明所述的一種米曲霉分泌制備錳過氧化物酶的方法，按照下述步驟進行：以米曲霉為出發菌株，以含有木質素的農作物秸稈為原料，進行試管擴大培養、液體搖瓶培養、一級種子培養和固體發酵培養，得到含有錳過氧化物酶的固態發酵物，然后進行提取得到含有錳過氧化物酶的米曲霉固體發酵物。