[發明專利]一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的引物及鑒別方法

無效

• 申請號: 201210169228.4
• 申請日: 2012-05-28
• 公開（公告）號: CN102676680A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 褚棟;國棟;陶云荔;杜蘭英
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 王緒銀

技術領域

本發明涉及一種基于PCR-RFLP技術鑒別Q型煙粉虱單倍型的引物及鑒別方法，屬于農業生物技術領域。

背景技術

煙粉虱Bemisia?tabaci（Gennadius）是一種世界性農業害蟲。由于它寄主譜廣、暴發性強、危害性大，被世界自然保護聯盟（IUCN）列為世界最具有危害性的100個入侵種之一。同時，也是國際科技界有史以來唯一冠以“超級害蟲”稱謂的昆蟲。近年來，隨著煙粉虱傳播的雙生病毒-番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）的擴散，煙粉虱的危害愈加嚴重，甚至導致江蘇、河南、山東等局部地區番茄絕產。煙粉虱含有多種生物型，其中B型與Q型是入侵性最強、分布最廣的2種生物型。近年來，許多學者認為B型煙粉虱與Q型煙粉虱分別是中東-亞細亞1（MEAM1）、地中海（MED）隱蔽種。B型煙粉虱起源于中東-亞細亞地區，自上世紀80年代在美國等地區暴發以來，至少傳入51個國家。Q型煙粉虱起源于地中海地區，2003年首次在我國云南省發現其入侵，隨后相繼在10多個非地中海國家被發現；目前，許多國家多年來持續開展了Q型煙粉虱的監測與控制研究。近來研究表明，Q型煙粉虱在2008年后已在全國廣大地區取代了B型煙粉虱而成為了作物上煙粉虱的優勢種。

當前在我國廣大地區危害的Q型煙粉虱，其原產地種群具有多個支系。基于mt?COI序列劃分的Q1與Q2支系其原產地分布區不同，Q1支系主要分布在地中海西部地區，而Q2支系則主要分布于地中海東部地區。盡管在10多個非地中海國家發現了Q型煙粉虱的危害，但是入侵支系并非完全相同。例如，在我國目前為止僅有Q1支系的煙粉虱入侵危害；而傳入美國的Q型煙粉虱則有Q1與Q2兩個支系。最新研究表明，基于mt?COI序列中國的Q1支系煙粉虱主要分為單倍型1（Hap1）和單倍型2（Hap2），且Hap1為主要單倍型。傳統的鑒定Q型煙粉虱單倍型的方法是采用測序的方法，該方法不僅費時，而且費用較高，不利于Q型煙粉虱的快速鑒定。不同單倍型的煙粉虱對寄主植物的危害程度不同，精確區分單倍型是有效防控Q型煙粉虱的前提和基礎，其對于Q型煙粉虱的綜合防控具有重要的理論意義和指導價值。

PCR-RFLP（限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應）技術，又稱為CAPS技術（Cleaved?Amplilfed?Polymorphism?Sequences），其基本原理是先利用已知位點的DNA序列資源（基因數據庫、基因組或cDNA克隆及克隆的RAPD條帶等）設計一套特異性的PCR引物（19～27bp），然后用這些引物擴增該位點上的某一DNA片段，接著用一種專性的限制性內切酶切割所得擴增產物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進行RFLP分析。該技術揭示的是特異PCR片段的限制性長度變異的信息。PCR-RFLP是一類共顯性分子標記，其優點是避免了RFLP分析中膜轉印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度-能夠揭示單個堿基的差異。另外，由于很多限制性內切酶均可與DNA擴增片段酶切，所以檢測到多態性機會較大。

PCR-RFLP技術已經廣泛應用于植物、動物、微生物以及昆蟲的物種檢測與鑒定、遺傳分化鑒定等方面。但利用PCR-RFLP技術構建區分Q型煙粉虱單倍型的方法目前還未見報道。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的引物及方法。

一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的引物，所述引物為一對，分別為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

正義引物Hap-F：5’-CTGGTTYTTTGGTCATCCRGARGT-3’；SEQ?ID?NO.1

反義引物Hap-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACAATAAACCMTAAGATACCAA-

TAGTCAATATAGCATAAATCAT-3’；SEQ?ID?NO.2

一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的方法，步驟如下：

（1）提取Q型煙粉虱基因組DNA，得基因組DNA溶液；

（2）以步驟（1）制得的基因組DNA為模板，利用上述的一對引物對基因組DNA中的線粒體COI基因進行PCR擴增，制得PCR擴增產物；

（3）用限制性內切酶Hin1II酶切步驟（2）制得的PCR擴增產物，得酶切產物；

（4）對步驟（3）制得的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，當PCR產物電泳圖譜顯示被測樣品有小于100bp的一條條帶時，則該被檢測樣品為Q型煙粉虱單倍型1（Hap1）；當PCR產物電泳圖譜顯示被測樣品有大于100bp的一條條帶時，則為Q型煙粉虱單倍型2（Hap2）。