[發明專利]一種利用線粒體分子標記快速鑒定縊蟶群體的方法

無效

• 申請號: 201210168243.7
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102776278A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 牛東紅;李家樂;沈和定;王劦;金凱
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

技術領域

本發明涉及一種縊蟶種質鑒定，具體說，涉及一種利用線粒體分子標記鑒定縊蟶群體的方法。

背景技術

縊蟶是我國四大海產養殖貝類之一，具有生長快、養殖周期短、易管理、產量高、效益好等養殖特點。據統計，我國貝類的養殖產量占海水養殖總產量的82%。灘涂貝類的年產量近200萬噸，其中縊蟶的產量就已經達到了70萬噸，約占我國灘涂貝類養殖總產量的30%，在我國海水養殖中占有重要的地位。

例如，我國浙江和福建一帶沿海是縊蟶的重要苗種產區，被運輸到其他沿海城市進行養殖和銷售。近幾年，隨著縊蟶養殖規模的不斷擴大，江蘇和上海沿海灘涂也逐步開始引種養殖。異地苗種引進和養殖容易導致異地苗種與土著苗種的混雜，因此如何區分不同地區苗種以期進行后期苗種選擇，種質資源保護和良種選育工作成為重要的課題。由于不同群體縊蟶表型相近，且容易受到環境因素的影響，因此依靠表型進行群體鑒別具有相當困難。線粒體屬于母系遺傳，變異速度較快，采用線粒體分子標記進行縊蟶群體的鑒別是非常可靠的分子生物學方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用線粒體分子標記鑒定縊蟶群體的方法，該方法可靠性高。

為實現本發明的目的，本發明的技術方案是：

一種利用線粒體分子標記快速鑒定縊蟶群體的方法，該方法包括以下步驟：

（1）采集縊蟶個體，提取DNA；

（2）合成線粒體細胞色素氧化酶I標記引物；

（3）對縊蟶群體的線粒體細胞色素氧化酶I(COI)基因進行PCR擴增；

（4）對PCR產物進行純化；

（5）對純化的PCR產物進行測序和序列比對。

在本發明的一優選實施例中，步驟（1）中，所述標記引物為：

Sc-COI-F：5’GGT?CAA?CAA?ATC?ATA?AAG?ATA?TTG?G?3’；

Sc-COI-R：5’TAA?ACT?TCA?GGG?TGA?CCA?AAA?AATCA?3。

在本發明的一優選實施例中，步驟（2）中，所述PCR擴增程序為：

（a）94℃預變性3min，進行35個循環：

（b）94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸50s；

（c）最后72℃延伸10min。

在本發明的一優選實施例中，步驟（2）中，所述PCR擴增所用反應體系為25μL，含10×Buffer?2.5μL，Mg2+2.0mmol/dm3，dNTP0.2mmol/dm3，TaqDNA聚合酶1U，上、下游引物各0.2μmol/dm3，模板DNA50-100ng。

本發明的方法，鑒別方法簡單，可靠性強。

附圖說明

圖1是縊蟶江滬群體和浙閩群體的線粒體分子標記細胞色素氧化酶I（COI）序列。

其中“*”表示江滬群體和浙閩群體的保守位點，“●”表示鑒別江滬群體和浙閩群體的堿基位點，JSSc,SHSc,ZJSc和FJSc分別表示江蘇，上海，浙江和福建縊蟶個體。

具體實施方式

下面結合實施例進一步說明本發明。

實施例1：利用本發明的方法，對縊蟶江滬群體和浙閩群體進行鑒別。

（1）采集江蘇、上海、浙江和福建沿海灘涂的縊蟶個體，提取DNA；

在我國江蘇、上海、浙江和福建沿海灘涂隨機采集縊蟶個體。利用解剖刀和鑷子分別收集四個地區的縊蟶個體的外套膜組織，置于無水乙醇中保存備用。

采用酚氯仿抽提法進行DNA抽提，具體方法如下。每個樣本取0.5g外套膜組織剪碎后，加入500μL組織勻漿緩沖液（10mmol/dm3?Tris-Hcl，PH=8.0;50mmol/dm3?EDTA，PH=8.0），混勻后加入終濃度為1%的SDS和200μg/cm3的蛋白酶K，55℃消化澄清。利用飽和酚抽提1次，然后利用等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)提取2次，再次利用氯仿：異戊醇(24：1)抽提1次，最后加入2倍體積預冷的無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌兩遍后干燥，無菌水溶解DNA。紫外分光光度計測定樣品DNA的OD260、OD280值，確定其濃度和純度，母液置于-20℃保存。

（2）合成線粒體細胞色素氧化酶I(COI)引物；

線粒體細胞色素氧化酶I(COI)引物的合成，采用固相亞磷酰胺三酯法，由DNA合成儀合成引物堿基序列，通過PAGE法純化引物。