[發明專利]一種檢測苯甲酸雌二醇的酶聯免疫試劑盒

無效

• 申請號: 201210167285.9
• 申請日: 2012-05-28
• 公開（公告）號: CN102721811A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 肖付剛;呂春霞;王德國;張曉偉;王加華
• 申請（專利權）人: 許昌學院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

一種檢測苯甲酸雌二醇的酶聯免疫試劑盒，屬于免疫分析技術領域。

技術背景

2008年的三聚氰胺事件，使三鹿集團倒閉，我國乳品企業重新洗牌，使人們對牛奶及其制品質量安全問題愈發關注。2010年8月某奶粉疑致女嬰性早熟的激素門事件又將乳制品推上了風口浪尖。牛奶中是否有雌激素的存在和奶牛產奶數量是否受到雌激素的作用是目前人民大眾急需了解的內容。無論是進口奶源，還是國內奶源，均有殘留激素的隱患。奶業和食品營養專家指出，奶牛吃的飼料或草料含有激素的可能性最大，在奶粉業這是一種隱形的存在；此外，在奶牛飼養中使用的催產素、催奶素等，也可能導致激素殘留。尤其近年來由于過量使用外源性性激素作為動物飼料添加劑和植物生長調節劑，導致大量食品中污染了性激素類物質。這些雌激素殘留，通過食物鏈在人體內積累，可誘發癌變，對生殖與神經等系統帶來影響，還造成嚴重的環境問題。

雖然國家在2008年制定了《乳品質量安全監督管理條例》，要求加強奶畜養殖、生鮮乳收購、乳品生產、經營、進口等各環節的監督檢查，明確規定禁止銷售、收購和加工尚處于用藥期和休藥期內的奶畜產，不符合健康標準或者沒有經過檢疫合格的奶畜產的，以及不合法規標準的生鮮乳，從源頭上控制生鮮乳的獸藥殘留。但是目前雌激素的檢測尚未列入國標中，乳制品企業也未將其作為生鮮乳收購的檢測項目，因此尚不能從源頭上消除雌激素的隱患。

要減小雌激素污染對食品安全和人體健康造成的威脅，必須加強市場監管，完善檢測手段。而乳制品中雌激素的殘留量一般較少，常規測定方法的應用受到限制，需要比較靈敏的檢測方法。目前苯甲酸雌二醇的檢測方法主要使用大型儀器，如HPLC、GC-MS、LC-MS等。但由于儀器設備價格昂貴，操作復雜、費時，不適用于大批量樣品的快速檢測，因此不能用于大批量樣品的現場快速篩查，不能在基層單位和企業得到推廣。而酶聯免疫分析(ELISA)法，由于其特異性強、靈敏度高、操作簡便、檢測速度快，特別適于大批量樣品的現場快速檢測等優點而越來越被人們所重視和采用。目前在真菌毒素、藻毒素等的快速檢測中ELISA法已經是最常用的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測苯甲酸雌二醇的酶聯免疫分析試劑盒及其檢測方法，用于對食品中苯甲酸雌二醇的檢測。

本發明的技術方案：該檢測苯甲酸雌二醇的試劑盒是由(1)96或48孔包被板，(2)苯甲酸雌二醇標準品，(3)苯甲酸雌二醇的單抗凍干品，(4)酶標記的羊抗鼠抗體凍干品，(5)洗滌液，(6)顯色液A，(7)顯色液B，(8)終止液所組成。

所述的酶標記的羊抗鼠抗體凍干品為HRP-羊抗鼠抗體凍干品，洗滌液為含有吐溫的Tris-HCl緩沖溶液，顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，顯色液B為四甲基聯苯二胺的乙醇水溶液，終止液為硫酸溶液。

本發明主要采用酶聯免疫分析法(ELISA)來檢測苯甲酸雌二醇。采用ELISA的技術主要有兩個方面：第一，特異性單克隆抗體的制備，利用抗原免疫小鼠，經細胞融合、選擇培養、腹腔注射，經培養后抽取腹水，得到抗苯甲酸雌二醇的單克隆抗體；第二，苯甲酸雌二醇-ELISA試劑盒的制備。

檢測苯甲酸雌二醇的酶聯免疫分析試劑盒的制備詳見實施例1和2。

苯甲酸雌二醇的測定方法為：取包被有苯甲酸雌二醇與載體蛋白偶聯物的微孔包被板，加入苯甲酸雌二醇標準或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入苯甲酸雌二醇抗體，振蕩反應，洗滌液洗滌，加酶標記的羊抗鼠抗體，進行標記免疫反應，洗滌液洗滌，加顯色液A和顯色液B，暗處靜置后加終止液，在450nm處測量吸光度，對照標準曲線計算樣品中的苯甲酸雌二醇含量。

本發明的有益效果：該試劑盒結構簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，檢測限可達10ng/mL，特別適于大批量樣品的現場快速檢測。

附圖說明

圖1為苯甲酸雌二醇酶聯免疫分析法的標準曲線。

具體實施方式

提供以下實施例是為了更好地理解本發明，而決不對本發明的內容和保護范圍構成任何限制。

實施例1抗苯甲酸雌二醇的單克隆抗體的制備

苯甲酸雌二醇是典型的半抗原，在免疫反應中只具有反應原性，需與大分子物質結合后才有免疫原性。我們采用多元酸酐法活化苯甲酸雌二醇，用混合酸酐法將活化的苯甲酸雌二醇與載體蛋白(KLH，BSA)偶聯，制備了免疫抗原苯甲酸雌二醇-KLH和包被抗原苯甲酸雌二醇-BSA。以合成的苯甲酸雌二醇-KLH作為人工合成的免疫抗原進行動物免疫，制備抗體。