[發明專利]檢測花色苷在靶細胞生物利用度的方法

有效

• 申請號: 201210165840.4
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102721675A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 易龍;糜漫天;陳明亮;金鑫
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及檢測領域，特別涉及檢測花色苷在靶細胞生物利用度的方法。

背景技術

花色苷是花色素與糖以糖苷鍵結合而成的一類化合物，廣泛存在于黑米、紫薯、葡萄、藍莓、甘藍等多種天然有色蔬菜和水果的花、果實、莖、葉和根器官的細胞液中。由于花色苷具有抗氧化、清除自由基作用、抗炎、降血脂、心血管保護、抗腫瘤、抗衰老、抗炎、保肝等作用，因此添加花色苷的食品備受人們喜愛。國內外以花色苷為原料的保健食品和膳食補充劑已經開始上市，其健康功效明顯。花色苷的抗氧化、清除自由基作用、減少血漿氧化型低密度脂蛋白（oxidized?LDL）形成、抗腫瘤、心血管保護、抗衰老、抗炎、保肝等功效與花色苷的在不同組織細胞的生物利用率有關。目前關于花色苷研究主要集中在腸道吸收和血、尿中代謝物檢測方面，但相關檢測結果無法反映在其他靶細胞的生物利用情況。同時，關于花色苷在不同的靶細胞的生物利用，目前沒有一種方便、敏感和準確的檢測方法。因此，急需一種檢測花色苷的方法，用于研究花色苷的在體內靶細胞的生物利用。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供檢測花色苷在靶細胞生物利用度的方法，該方法操作簡單，檢測時間短，可檢范圍寬，不需要特殊設備，即能定性還能定量分析。

為實現上述目的，技術方案為：

檢測花色苷在靶細胞生物利用度的方法，包括以下步驟：

a.用終濃度為1～200μM的花色苷處理靶細胞，得處理靶細胞；

b.將步驟a所得處理靶細胞先用PBS洗滌，再用胰蛋白酶消化，計數細胞，然后破碎細胞，最后離心收集上清液，備用；

c.將步驟b所得上清液用氮氣干燥，干燥后溶于pH=3～3.5的甲醇溶液中，測定在最大接收波長的熒光強度；

d.準確稱取花色苷，溶于pH=3～3.5的甲醇溶液中，配置成濃度梯度的標準液，然后測定標準液在最大接收波長的熒光強度，根據標準液濃度和熒光強度繪制標準曲線；然后根據標準曲線計算步驟c所得熒光強度的花色苷濃度，用生物利用度=花色苷濃度×樣品體積計算花色苷在靶細胞的生物利用度。

本發明中，pH=3~3.5的甲醇溶液的配制方法：取分析純甲醇溶液200mL，用濃度為1M的鹽酸逐滴加入，至pH計測定溶液pH=3~3.5即得。

進一步，所述步驟a是將花色苷溶于pH=3的甲醇溶液中，然后加入靶細胞中至花色苷終濃度為1～200μM，在37℃、100%飽和濕度、體積分數為5%的CO₂培養箱中培養至少1小時。

進一步，所述步驟a是用終濃度為50-200μM的花色苷處理靶細胞。

進一步，所述步驟b中，所述胰蛋白酶消化是用質量分數為0.25%～0.5%的胰蛋白酶消化；

進一步，所述破碎細胞為在功率為100W的超聲破碎儀中超聲至少10分鐘；所述離心為在溫度為4℃、12000轉/分鐘條件下離心10分鐘。

進一步，所述步驟b中，所述胰蛋白酶消化后，破碎細胞前還包括如下步驟，離心收集收集細胞，加入1mL，pH=3.0的甲醇溶液重懸細胞，準確收集1×10⁶個細胞。

進一步，所述步驟d中，所述濃度梯度的標準液是將花色苷溶于pH=3的甲醇溶液，配制成花色苷濃度分別為0.1μM，1μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM，160μM和320μM的標準液。

進一步，所述靶細胞為血管內皮細胞，小腸上皮細胞，肝細胞或腫瘤細胞。

進一步，所述花色苷為飛燕草素或矢車菊素。

本方法的有益效果在于：本發明公開了檢測花色苷在靶細胞生物利用度的方法，利用了花色苷的自發熒光特性，運用熒光分光光度計檢測花色苷在體內靶細胞的熒光強度，經過計算得出花色苷在靶細胞的生物利用率，該方法操作簡單，檢測時間短，檢測線性范圍寬，每10⁶個細胞最低檢測濃度低至0.1nmol，最高檢測濃度達100nmol，結果準確性高，靈敏度高，重復性好，為進一步研究花色苷的亞細胞定位分布、生物學活性和作用機制奠定了基礎，同時為利用分子修飾研制具有組織靶向性的治療藥物提供理論依據。

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附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中：

圖1為本發明熒光分光光度計對飛燕草素（delphinidin）的全波長掃描圖。

圖2為本發明飛燕草素在血管內皮細胞生物利用度。