[發明專利]間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201210165773.6
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102690351A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 陳東;張海燕;龐醒華
• 申請（專利權）人: 杭州傲銳生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華;徐關壽

技術領域

本發明屬于基因工程和免疫學技術領域，特別是一種間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體的制備方法，所得單克隆抗體可應用于酶聯免疫法檢測間日瘧原蟲，也可作為間日瘧原蟲快速診斷試劑盒的一部分。

背景技術

瘧疾廣泛流行于熱帶和亞熱帶發展中國家，是一種由蚊媒傳播的嚴重危害人類健康的寄生蟲病。間日瘧原蟲對人類的危害僅次于惡性瘧原蟲，據估計全球收到間日瘧原蟲感染的人口高達26億，每年約有0.8~3億的人口因受到間日瘧原蟲感染而急性發作，在我國，2000年后瘧疾疫情呈上升趨勢，每年估計有70萬左右瘧疾患者，其主要是間日瘧患者，盡管2007年后疫情得到遏制，但是其流行程度仍然處于上升趨勢。

采用傳統的厚血膜鏡檢費時費力，檢測效率低下，近年來，核酸檢測方法在瘧疾診斷中得以應用，雖然該方法具有高度的特異性和敏感性，但是技術要求較高，需要技能熟練的操作員，阻礙了該方法的進一步普及。因此，尋求靈敏特異，簡便快速的瘧疾診斷方法在當前瘧疾防治工作中顯得尤為重要。開發具有高靈敏度、高特異性的間日瘧抗體是建立間日瘧體外診斷技術的首要任務。

間日瘧原蟲的宿主只有兩個，人和按蚊。通過中間宿主按蚊傳播疾病，被感染的人患瘧疾。其生活史分為三個時期：紅細胞外期、紅細胞內期和紅細胞期，只有紅細胞內期發生在紅細胞內，其余兩個發生在肝細胞中。

瘧疾特異性檢測（RDTs）是一種可以檢測瘧疾寄生蟲特異性抗原的橫向層析方法。RDTs方法提高了瘧疾診斷和實例診斷的準確性，尤其是當鏡檢不可用或者不可靠的情況下。市場上已經有很多種RDT產品可以購買，其中一些是只可以檢測惡性瘧原蟲，而其他的一些可以檢測惡性瘧原蟲同時檢測出一種甚至三種以上的人源瘧疾。RDTs檢測中主要是以HRPⅡ和瘧原蟲乳酸脫氫酶為靶抗原來檢測惡性瘧原蟲，然而瘧原蟲pan-specific乳酸脫氫酶和醛縮酶通常被當作檢測另外三種瘧原蟲的靶抗原。醛縮酶是瘧原蟲糖酵解過程中的關鍵酶。與高等脊椎動物擁有三種醛縮酶（同工酶）不同的是，間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲擁有同一種醛縮酶，與錐體蟲和賈第蟲類似。間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲的醛縮酶都含有390個氨基酸，他們的核苷酸和氨基酸序列的相對保守。因此，本申請選用醛縮酶作為靶抗原，分析其序列，選擇其優勢抗原表位，篩選反應靈敏度高，特異性強的單克隆抗體，以降低以HRPⅡ和瘧原蟲乳酸脫氫酶為靶抗原可能出現的漏檢風險。

發明內容

本發明的目的在于提供一種間日瘧原蟲醛縮酶(aldolase)蛋白單克隆抗體的制備方法。由該方法所得的間日瘧單克隆抗體反應靈敏度高，特異性強，成本低，可大規模制備作為商品化檢測試劑盒的原料。

間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC將間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的抗原表位A、B、C相連接，得到重組子D；其中，

抗原表位A的核酸序列為：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC?AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT；

抗原表位B的核酸序列為：ATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA?GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC；

抗原表位C的核酸序列為：AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG?GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；