[發明專利]間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201210165773.6
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102690351A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 陳東;張海燕;龐醒華
• 申請（專利權）人: 杭州傲銳生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華;徐關壽

1.間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC將間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的抗原表位A、B、C相連接，得到重組子D；其中，

抗原表位A的核酸序列為：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC?AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT；

抗原表位B的核酸序列為：ATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA?GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC；

抗原表位C的核酸序列為：AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG?GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；

重組子D的核酸序列為：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC?AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCTGGCAGCGGCAGCGGCATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTAGGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACCGGCAGCGGCAGCGGCAACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGGGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；

（2）?將重組子D和載體PET-28a（+）用BamHI和XhoI進行雙酶切，將重組子D連接到載體PET-28a（+）上，轉化大腸桿菌BL21，篩選得到重組蛋白D表達菌株；

（3）?誘導表達重組蛋白D：重組蛋白D的氨基酸序列為：GluGlyIleIleProGlyIle?LysValAspLysGlyLeuValThrIleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAlaGlySerGlySerGlyIleGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThrGlySerGlySerGlyAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu；

（4）將獲得的重組蛋白D超聲破碎并低溫離心，溶液上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱，洗脫得到純化重組蛋白D；

（5）用純化后重組蛋白D免疫Balb/c小鼠，多次免疫尾靜脈采血測定血清效價后，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，并用HAT篩選得到穩定的雜交瘤細胞株；

（6）將雜交瘤細胞株注射到液體石蠟預處理的F1小鼠腹腔，隔周取腹水，50%飽和硫酸銨沉淀法和Protein?G親和純化單抗，得到單克隆抗體。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的抗原表位A的氨基酸序列為：GluGlyIleIleProGlyIleLysValAspLysGlyLeuValThrIlePro?CysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAla。