[發(fā)明專利]果蠅視網(wǎng)膜發(fā)育模型的體外培養(yǎng)系統(tǒng)及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210165419.3
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102757931A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發(fā)明（設計）人: 儲丹丹;陳炯
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種果蠅視網(wǎng)膜發(fā)育模型的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，及其在視網(wǎng)膜發(fā)育相關基因和藥物篩選中的應用。

背景技術

果蠅由于其飼養(yǎng)方法簡單低廉，繁殖迅速且大量，基因組精簡清晰便于研究，遺傳手段較多且操作簡便等優(yōu)點，被科學界公認為一種優(yōu)良的模式生物。自從20世紀初，摩爾根利用果蠅證實了孟德爾定律，提出了遺傳學第三定律-“連鎖與交換定律”并因此獲得1933年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎之后，基于果蠅的研究逐步揭示了胚胎發(fā)生和器官發(fā)育的分子調(diào)控機理。經(jīng)大批科學家長時間的研究成果證實，果蠅中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)發(fā)育機理，在哺乳動物(包括人類)中有高度的保守性。

果蠅的復眼盡管和人眼在形態(tài)上有很大的差別，但它們都是由晶狀體，色素層(鞏膜)和視網(wǎng)膜這三種基本的成像結(jié)構(gòu)組成。任何一部分結(jié)構(gòu)的發(fā)育異常都是致盲的。視網(wǎng)膜發(fā)育相關的重要基因和信號通路，大多在果蠅中最先發(fā)現(xiàn)。比如著名的Wnt信號通路，它幾乎調(diào)控眼睛發(fā)育所有步驟(包括胚胎期眼睛區(qū)域決定，眼睛形態(tài)發(fā)生，細胞增殖分化和凋亡，視網(wǎng)膜神經(jīng)形成和生長等等)，就是最先在果蠅中發(fā)現(xiàn)的。隨后在果蠅中的相關研究幫助科學家們理解了哺乳動物中的Wnt通路，而果蠅中的這些成果也因此獲得了1995年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。隨后的大量研究表明，這些重要基因和信號通路在人類中同樣影響包括眼睛在內(nèi)的多種器官發(fā)育；而相關基因的異常調(diào)控和表達，會造成各種器官發(fā)育異常，甚至導致腫瘤生成和轉(zhuǎn)移。如今，果蠅視網(wǎng)膜已經(jīng)發(fā)展為一種理想的人類眼部疾病模型，應用于研究常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性(Autosomal?Dominant?Retinitis?Pigmentosa)這類遺傳性眼部疾病，以及亨廷頓氏舞蹈癥(Huntington′s?Disease)，帕金森病(Parkinson′s?disease)和阿爾茨海默病(Alzheimer’s?Disease)等神經(jīng)退化性疾病引發(fā)的視覺功能退化。因此，探索果蠅視網(wǎng)膜早期發(fā)育的過程，對于揭示人類眼睛等器官發(fā)育的細胞和分子機理，闡釋各種眼部疾病的發(fā)病機理，以及藥物篩選和毒理學評價等領域都有十分重要的意義。

目前對果蠅視網(wǎng)膜早期發(fā)育過程的理解，還停留在上世紀90年代初期。Wolff，Ready，Cagan等科學家通過對果蠅視網(wǎng)膜固定片的觀察，推測了視網(wǎng)膜每隔兩小時的發(fā)育進程，提出了關于視網(wǎng)膜形態(tài)發(fā)育(Morphogenesis)方式的一些假說。然而，由于早期視網(wǎng)膜發(fā)育過程無法在體內(nèi)進行觀察，也缺少有效的體外培養(yǎng)方法，所以其兩小時內(nèi)的實時發(fā)育細節(jié)至今還沒有能夠弄清，關于視網(wǎng)膜形態(tài)發(fā)育過程的假說也依然只是猜測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是建立一種能夠?qū)崟r追蹤記錄果蠅視網(wǎng)膜早期發(fā)育模型的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，具體技術方案包括以下步驟：

1.配制用于果蠅視網(wǎng)膜體外培養(yǎng)的器官培養(yǎng)液，器官培養(yǎng)液由體積百分含量的以下組分構(gòu)成：89％昆蟲細胞培養(yǎng)基(Schneider’s?Drosophila?medium)、10％熱滅活胎牛血清(heat-inactivated?feral?bovine?serum)、1％青霉素-鏈霉素混合溶液(penicillin/streptomycin)，0.2mg/ml胰島素(insulin)。

2.室溫條件下，在器官培養(yǎng)液中解剖分離出含有熒光標記(如E-cadherin-GFP)的果蠅三齡后期幼蟲視網(wǎng)膜，將其取出并完全浸透于透氣底膜(Lumox?dish，Sigma)上的新鮮培養(yǎng)液中，加蓋四周涂有聚三氟氯乙烯(Halocarbon?700oil)的蓋玻片(18X18mm)，使視網(wǎng)膜穩(wěn)固封閉于“透氣底膜-蓋玻片-聚三氟氯乙烯-器官培養(yǎng)液”所構(gòu)成的厚度約0.3-0.6mm的液體腔內(nèi)。

3.運用激光共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測視網(wǎng)膜發(fā)育進程。選取物鏡為60倍或100倍，激光強度設定為0.1％-10％，每隔10分鐘(或其他大于10分鐘且小于3小時的間隔時間)調(diào)整焦距至圖像清晰，掃描采集并分析視網(wǎng)膜形態(tài)發(fā)育過程。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種快速篩選與視網(wǎng)膜早期發(fā)育相關基因的方法，具體技術方案如下：

1.將含有某突變基因(a^-)的果蠅與含有熒光標記基因(如E-cadherin-GFP)的果蠅交配，整合出如下基因型的果蠅：E-cadherin-GFP；a^-。