[發明專利]基于固相合成的多肽的切割法

有效

• 申請號: 201210165089.8
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102702305A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 趙恒樂;周純澤;張宏怡;董昱;陳康宜
• 申請（專利權）人: 上海電機學院
• 主分類號: C07K1/06
• 分類號: C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽;曾人泉

技術領域

本發明涉及生物化學與分子生物學領域，具體的是基于固相合成的多肽的一種切割方法，是根據肽序中氨基酸的不同而選用不同的切割液并能洗脫出多肽的一種切割方法。

背景技術

多肽（polypeptide）是α－氨基酸以肽鏈連接在一起而形成的化合物，也是蛋白質水解的中間產物，簡稱為肽。由兩個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽，同理類推還有三肽、四肽、五肽……一直到九肽。通常由10～100氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫多肽。它們的分子量低于10，000Da（Dalton道爾頓），能透過半透膜，不被三氯乙酸及硫酸銨所沉淀。

多肽有生物活性多肽和人工合成多肽兩種。生物提取的多肽具有很強的活性，所以叫做活性肽。只有活性肽才能對人體產生很好的效果。但是人工合成的多肽有很多是沒有活性的，是需要篩選的，只有活性肽才能被人體安全使用。

人體的很多活性物質都是以肽的形式存在的。肽涉及人體激素、神經、細胞生長和生殖各領域，是涉及人體內多種細胞功能的重要物質，是人體重要的生理調節物，具有重要的生物學功能。肽對生命的存在非常重要。

多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，總的來說分成兩種：固相合成和液相多肽合成。1963年，Merrifield首次提出固相多肽合成方法（SPPS），這是在多肽化學研究上具有里程碑意義的合成方法。Merrifield經過反復篩選，放棄了芐氧羰基（Z）在固相上的使用，發明了將叔丁羰基（BOC）用于保護ɑ----氨基并在固相合成上進行使用。1972年，Lou?Carpino首先將9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保護ɑ----氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除且反應條件溫和，因而得到廣泛使用。

多肽固相合成順序一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成，涉及多步反應，其原理是按照所需要的肽序將各種氨基酸連接起來合成一個生物大分子——多肽。在合成過程中通過將要合成肽序末端氨基酸的羧基適當連接分子鍵合于不溶性高分子樹脂上，并用結合在固相載體上的氨基酸作為組分，再經過脫去氨基酸保護基與過量的活化羧基組分反應連接長的肽序，達到所需的多肽，然后再選擇適當的切割液去除側鏈保護基和從樹脂上裂解的產物。

現有對側鏈保護基及樹脂的切割方法——標準氫氟酸（HF）切割法，其步驟包括：

A、將多肽樹脂倒入離心管中，再向離心管中加入切割液：

肽序中含半胱氨酸(Cys)的多肽選用由HF/苯甲醚/二甲基硫(DMS)/苯甲硫醚構成的切割液，它們的比例為10:1:1:0.2；

肽序中不含半胱氨酸的多肽選用由HF/苯甲醚/二甲基硫構成的的切割液，它們的比例為10:1:1；

B、經過一段時間的反應后再通入氮氣以蒸發HF和DMS；

C、用三氟乙酸(TFA)吸取切除下的多肽；

D、將樹脂與多肽通過負壓作用從砂芯漏斗中分離出來，然后在離心管中倒入足量的乙醚析出粗品多肽；

E、將乙醚與多肽搖勻于離心管中使其成為溶液；將離心管放入離心機使肽得以沉淀；復用乙醚清洗多肽以洗掉切割液獲得較為純凈的肽；

F、去掉最后一遍洗滌多肽的乙醚，將離心管的蓋子旋緊放入干燥器用油泵抽干乙醚。

現有HF切割法的不足之處是：

（1）氫氟酸（HF）是一種酸性極強、具有高毒性的物質，一旦吸入HF氣體將危害人體甚至導致人員死亡，HF氣體的溢出會對環境造成嚴重污染。

（2）HF具有強腐蝕性，不可在玻璃儀器中進行多肽的切割，須在特殊材料的儀器中進行實驗。

（3）用HF切割多肽的操作難度大，因此必須在能耐強腐蝕的通風櫥中進行；操作員必須佩戴眼罩、防毒面具、耐腐蝕橡膠手套等防護裝備。

（4）用HF切割后使用氮氣蒸發HF和DMS增添了操作的復雜性。

（5）反應中可能帶有氨基酰化等副反應參與。

發明內容

本發明為解決上述問題，提供一種基于固相合成的多肽的切割法，所述的多肽為基于BOC法或FMOC法合成的多肽，本切割法主要是根據肽序中氨基酸的不同而選用不同的切割液并能方便地洗脫出多肽的一種切割方法，能獲得低污染、高產量的多肽。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案如下。

一種基于固相合成的多肽的切割法，所述的多肽為基于BOC法或FMOC法合成的多肽，其特征是，包括以下步驟：

（1）配制切割液

首先，配制三種濃度不同的切割液：