[發(fā)明專利]重組轉錄激活子樣效應因子、轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210164979.7
• 申請日: 2012-05-23
• 公開（公告）號: CN102702335A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設計）人: 肖磊;趙金龍;吳昭
• 申請（專利權）人: 上海斯丹賽生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N9/22;C12N15/55;C12N15/63;C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其涉及一對與胰島素基因識別相關的多肽、一對重組轉錄激活子樣效應因子、一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用。?

背景技術

人insulin基因是人胰島素編碼基因。胰島素是由胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。胰島素是機體內唯一降低血糖的激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成.胰島β細胞受損,胰島素分泌不正常會引起糖尿病.糖尿病（diabetes）是胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要特點，典型病例可出現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦等表現(xiàn)，即“三多一少”癥狀，糖尿病（血糖）一旦控制不好會引發(fā)并發(fā)癥，導致腎、眼、足等部位的衰竭病變，且無法治愈。對內源胰島素基因進行定向基因修飾有利于胰島素基因功能,糖尿病發(fā)病機理和胰島β細胞定向分化的研究.?

按照人類的意愿對基因組進行定向靶向修飾一直是許多科學家的夢想。在內源的基因組上特異地刪除或加入我們需要的序列，一方面可以構建出各種動物模型用于生物學基礎研究和疾病機理研究，另一方面可以生產動物反應器用以廉價生產我們需要的又很難從其他途徑得到的生物組分。?

人們一直沒有找到簡單高效的方法對基因組進行基因組靶向修飾。傳統(tǒng)的基因打靶技術依賴于細胞內自然發(fā)生的同源染色體隨機交換，其打靶效率非常低，通常只有10^-6-10^-8，這種打靶方法只在小鼠中得到了廣泛了應用，而在其他模式動物及大型哺乳動物中都因效率太低而得不到廣泛應用。?

近年發(fā)展很快的序列特異的核酸酶可以用于精確的基因組靶向修飾。一般由序列特異的核酸酶由一個DNA識別結構域和一個非特異性核酸內切酶結構域構成。原理是首先由DNA識別域把核酸酶定位到需要編輯的基因組區(qū)域，然后非特異性核酸內切酶切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂（double-strand?break，DSB），引入的DSB激活的DNA自我修復可以引起基因的突變和促進該位點DNA同源重組。鋅指核酸酶（Zinc-finger?nucleases，ZFN）是現(xiàn)在研究最清楚也是應用最廣的序列特異的核酸酶。其原理是兩個鋅指蛋白特異識別兩段相隔5-7bp的DNA序列，并把與之融合表達的非特異性DNA切割蛋白Fok1的兩個單聚體定位到了一起，DNA切割蛋白形成雙聚體時可以切斷該位置的雙鏈DNA，從而造成DSB。ZFN的出現(xiàn)使基因組靶向修飾技術向前邁進了一大步，然而，ZFN技術還存在靶向不確定性、效率低、拖把率高等問題，研究者很難自行設計出特異和高效的靶向基因組目的序列的鋅指核酸酶仍然是制約ZFN廣泛應用的瓶頸。而商業(yè)購買高效特異的鋅指核酸酶又價格昂貴（20萬人民幣/基因），一般研究者或商業(yè)公司根本無法承受這筆費用。?

2009年兩個研究組發(fā)現(xiàn)植物病原體Xanthomonas中的一種可以調節(jié)植物基因表達的轉錄激活子樣效應因子（transcription?activator-like?effector，TALE）表現(xiàn)出DNA結合特異性，而其識別密碼具有模塊化和簡單化的特點，為科學家們開發(fā)出更簡易的新型基因組靶向修飾技術帶來了新希望。?

TALE與Fok1融合后即形成轉錄激活子樣效應因子核酸酶（transcription?activator-like?effector?nucleases，TALEN）。TALEN的打靶原理與ZFN相同，只是識別特異DNA的蛋白不同。TALEs由數(shù)十個特異性識別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側的N-末端及C-末端序列組成。每個“蛋白模塊”包含34個氨基酸，第12和13位殘基是靶向識別的關鍵位點，被稱作重復可變的di-residues（RVDs）位點。然而不同于每個鋅指蛋白識別特異性的三聯(lián)體堿基，TALEs上的每個RVDs僅能識別一個堿基。?

Sangamo?BioSciences公司和哈佛大學的兩個研究小組分別利用TALEs技術進行了基因組靶向修飾相關研究，兩篇研究論文發(fā)表在同一期的《自然生物技術》（Nature?Biotechnology）雜志上。?