[發明專利]人源dcf1基因轉基因果蠅模型的構建方法

有效

• 申請號: 201210164601.7
• 申請日: 2012-05-25
• 公開（公告）號: CN102766635A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 文鐵橋;蔣萌
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/85;A01K67/033
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

技術領域

本發明涉及了一種轉基因果蠅模型的構建方法，特別是一種人源dcf1基因轉基因果蠅模型的構建方法。

背景技術

果蠅（Drosophila?melanogaster）具有高度發達的神經系統以及較短的生命周期，易飼養且易于進行遺傳學、細胞生物學、分子生物學手段的操作和分析，是一種非常實用的模式生物。所有，果蠅廣泛地用于神經退行性疾病模型的構建和研究。

樹突狀細胞因子（dendritic?cell?factor?1，DCF1）又名跨膜蛋白59（transmembrane?protein?59，TMEM59），首次發現于免疫系統的樹突細胞中，是一個表達范圍比較廣泛的單次跨膜蛋白。目前對于該蛋白的功能研究報道比較少，已有的報道表明DCF1主要定位在高爾基體上，且DCF1與其同源蛋白TMEM59-like能夠抑制APP向細胞膜的轉運以及進一步的剪切，說明DCF1與AD存在某種聯系。

Alzheimer’s?disease（AD），又稱老年癡呆癥，是由一名叫Alois?Alzheimer的德國醫生于1906年第一次報道的，以不可逆進行性的記憶減退和認知、語言功能障礙以及定向力、運動能力障礙等為主要臨床表現的一種神經退行性疾病。AD是老年人的常見病與多發病，全球有超過1500萬的老年人正受到AD的侵蝕和折磨。AD嚴重危害老年人的身心健康，已成為僅次于心臟病、惡性腫瘤和中風的第4位導致老年人死亡的原因，也是老年醫學中亟待解決和最棘手的問題之一。AD的發病機制目前學說眾多，如自由基損傷學說、膽堿能學說、鈣平衡失調學說、興奮性氨基酸毒性學說等。AD的患者一般表現為皮質神經元丟失，并伴隨有細胞外由APP剪切產生的大量β淀粉樣肽（amyloid?β-peptides,?Aβs）沉積形成的老年斑和大量神經細胞內異常過度磷酸化tau蛋白聚集且以雙螺旋絲的形式形成神經原纖維纏結（neurofibrillary?tangle,?NFT）。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人源dcf1基因轉基因果蠅模型的構建方法。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種人源dcf1基因轉基因果蠅模型的構建方法，其特征在于該方法的具體步驟為：a.將人源dcf1基因開放式閱讀框對應的cDNA序列構建入果蠅轉基因載體pWIZ中，得到果蠅轉基因載體pUAST-dcf1；

b.將步驟a所得果蠅轉基因載體pUAST-dcf1為材料，利用顯微注射的基因工程技術手段構建并得到人源dcf1轉基因果蠅。

上述的步驟a的具體方法可以為：

a-1.以人子宮頸癌細胞HeLa細胞的cDNA為模版進行PCR擴增，引物為：

dcf1?primers：?????5’-CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGG?AG-3’

5’-GCTCTAGATTAAATTTCAGAATGAGCAA-3’)，

得到大小為972bp的dcf1基因開放式閱讀框全長的目的片段；再用EcoRI和XbaI雙酶切，收集片段；

a-2.用EcoRI和XbaI雙酶切空載體質粒pWIZ，收集大片段備用；

a-3.將步驟a-1和步驟a-2所得的兩個片段連接起來，得到果蠅轉基因載體pUAST-dcf1。

上述的步驟b的具體步驟為：

b-1.將轉基因載體pUAST-dcf1（終濃度0.8?μg/mg）和輔助質粒pΔ2-3（終濃度0.2?μg/mg）混合后，將此混合液注入果蠅的受精卵的尾部，并放置在16℃的濕盒中培養；

b-2.待步驟b-1所得的受精卵孵化成幼蟲然后羽化為成蟲后即和野生型w1118交配，挑取子代眼色為紅色的果蠅即為轉基因果蠅；

b-3.將步驟b-2所得轉基因果蠅和Double?Balance果蠅以及野生型w1118雜交，篩選出基因型為w;UAS-dcf1/UAS-dcf1;+/+的果蠅。

本發明利用顯微注射基因工程技術和果蠅雜交技術，構建了人源dcf1基因轉基因果蠅模型，為相關神經退行性疾病的研究提供了材料和新思路。

附圖說明

圖1為構建的果蠅轉基因載體pUAST-dcf1經限制性內切酶EcoRI和XbaI雙酶切產物的電泳圖，最左邊泳道為DNA?Marker，泳道1、2均為pUAST-dcf1雙酶切產物。

圖2為顯微注射操作時果蠅的受精卵的狀態。