[發明專利]一種測定痕量艾塞那肽的方法

有效

• 申請號: 201210164281.5
• 申請日: 2012-05-24
• 公開（公告）號: CN103424496A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 沙春潔;張金鳳;孫瑜;韓江彬;王濤;劉萬卉
• 申請（專利權）人: 山東綠葉制藥有限公司
• 主分類號: G01N30/36
• 分類號: G01N30/36
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種采用液相色譜與質譜聯用技術測定痕量艾塞那肽的方法。

背景技術

艾塞那肽是人工合成的腸促胰島素類似物GLP-1家族的第一個成員，它模擬人體生理狀態下分泌GLP-1的生物模式，從腸內釋放入循環中后可以增強葡萄糖依賴性胰島素分泌。艾塞那肽的氨基酸序列與人類GLP-1部分重疊，在體外顯示可以結合并活化已知的人類GLP-1受體，通過包括cAMP和/或其他細胞內信號傳導機制使葡萄糖依賴性胰島素合成及胰島β細胞在體內分泌胰島素增加。在葡萄糖濃度升高的情況下，艾塞那肽可促進胰島素從β細胞中釋放同時艾塞那肽通過減少2型糖尿病患者空腹和餐后血糖濃度，從而改善血糖控制。

艾塞那肽已上市的產品主要有注射劑，僅用于皮下注射。推薦起始劑量為5μg，每日兩次，治療1個月后，可根據臨床反應將劑量增加至10μg。艾塞那肽臨床常見的不良事件為惡心、低血糖、腹瀉、嘔吐、頭痛及不安感，在患者開始治療和增加劑量時發生頻率高。可以看出艾塞那肽的劑量對臨床不良反應有密切相關性，因此臨床治療時應密切監測其血漿水平。艾塞那肽臨床極低的用量，就可能引起極強的臨床不良反應，這些情況都迫切需要建立一種操作簡單，特異性好及高靈敏的痕量艾塞那肽檢測技術，目前血漿等生物樣品中痕量艾塞那肽的檢測是利用放射免疫法(RIA)或酶聯免疫(ELISA)進行測定，RIA需要具備尖端復雜的設備，且成本也不低。同時，RIA還需要特殊的預防措施，因為其要用到放射性物質。ELISA方法線性范圍窄，需要大量的樣品稀釋工作，且樣品處理周期長(至少6h)，對人員操作要求高，同時試劑盒成本高，儲存條件苛刻，試劑盒穩定性等問題。LC-MS/MS隨著技術提高，已開始應用于多肽檢測，文獻《Application?of?DBS?for?quantitative?assessment?of?the?peptide?Exendin-4；comparison?of?plasma?and?DBS?method?by?UHPLC-MS/MS》--Bioanalysis.，2010，2(8)，1461-1464，提到采用液相色譜與質譜聯用技術，檢測艾塞那肽的血漿濃度，LLOQ即定量下限(最低定量限)為10ng，但仍然滿足不了臨床及實驗研究對痕量艾塞那肽檢測的需要。

發明內容

針對現有技術存在的缺陷，本發明人進行深入研究，提供一種操作簡單、結果準確、特異性好、靈敏度高的痕量艾塞那肽的測定方法。所述方法采用液相色譜與質譜聯用技術，其高效液相的流動相采用含酸的水溶液-甲醇體系進行梯度洗脫，所述酸為甲酸或乙酸，優選為甲酸；酸的體積百分濃度0.01-2％，優選為0.05-0.5％，更優選為0.2％。所述體積百分濃度為100ml水中所含酸的體積(ml)數。

在液質聯用方法中，液相色譜流動相的選擇具有非常重要的作用。本發明所述流動相的有機相選擇甲醇，相比乙腈等其他有機溶劑，甲醇在測定痕量艾塞那肽時有更高的響應值和較好的色譜行為；流動相的水相中添加酸可明顯提高方法的靈敏度，其中添加甲酸、乙酸比其他酸有一定的優勢，優選甲酸；采用本發明檢測方法檢測標準溶液樣品中的痕量艾塞那肽，檢測限可達到0.01ng/ml，檢測血漿樣品中的艾塞那肽，最低定量限可達到0.1ng/ml。

本文所述檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。常用信噪比法，即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比為3∶1或2∶1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。

本文所述LLOQ是lower?limit?of?quantification，即定量下限(最低定量限)。FDA規定LLOQ點的S/N＞5和LLOQ點的CV＜20％，S/N即信噪比，CV是變異系數，它等于標準差/平均值。

所述梯度洗脫含酸水溶液和甲醇的體積比具體如下表：

本發明另一方面還涉及所述測定痕量艾塞那肽的方法用于檢測哺乳動物在使用艾塞那肽制劑后體內艾塞那肽的含量及其變化過程的用途。通過本發明所述的方法能夠成功檢測樣品中的痕量艾塞那肽，實現在使用艾塞那肽制劑后，檢測其體內艾塞那肽的含量及其變化過程。