[發明專利]一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201210163376.5
• 申請日: 2012-05-23
• 公開（公告）號: CN102702331A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 肖磊;趙金龍;吳昭
• 申請（專利權）人: 上海斯丹賽生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/11;C12N9/22;C12N15/55;C12N15/63;C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術領域

本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用。

背景技術

人RPE65基因名為視網膜色素上皮基因，編碼視網膜色素上皮中一個分子量為65kDa的重要蛋白質，參與視黃醛等物質循環、視色素視紫紅質再生等關鍵步驟。人若缺乏該基因編碼的蛋白質，則11-順式視黃醛缺失，視桿細胞對光照刺激將不起反應，該基因的突變會導致萊伯先天性黑蒙(LCA2)和視網膜色素變性。

按照人類的意愿對基因組進行定向靶向修飾一直是許多科學家的夢想。在內源的基因組上特異地刪除或加入我們需要的序列，一方面可以構建出各種動物模型用于生物學基礎研究和疾病機理研究，另一方面可以生產動物反應器用以廉價生產我們需要的又很難從其他途徑得到的生物組分。

人們一直沒有找到簡單高效的方法對基因組進行基因組靶向修飾。傳統的基因打靶技術依賴于細胞內自然發生的同源染色體隨機交換，其打靶效率非常低，通常只有10^-6-10^-8，這種打靶方法只在小鼠中得到了廣泛了應用，而在其他模式動物及大型哺乳動物中都因效率太低而得不到廣泛應用。

近年發展很快的序列特異的核酸酶可以用于精確的基因組靶向修飾。一般由序列特異的核酸酶由一個DNA識別結構域和一個非特異性核酸內切酶結構域構成。原理是首先由DNA識別域把核酸酶定位到需要編輯的基因組區域，然后非特異性核酸內切酶切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂（double-strand?break，DSB），引入的DSB激活的DNA自我修復可以引起基因的突變和促進該位點DNA同源重組。鋅指核酸酶（Zinc-finger?nucleases，ZFN）是現在研究最清楚也是應用最廣的序列特異的核酸酶。其原理是兩個鋅指蛋白特異識別兩段相隔5-7bp的DNA序列，并把與之融合表達的非特異性DNA切割蛋白Fok1的兩個單聚體定位到了一起，DNA切割蛋白形成雙聚體時可以切斷該位置的雙鏈DNA，從而造成DSB。ZFN的出現使基因組靶向修飾技術向前邁進了一大步，然而，ZFN技術還存在靶向不確定性、效率低、拖把率高等問題，研究者很難自行設計出特異和高效的靶向基因組目的序列的鋅指核酸酶仍然是制約ZFN廣泛應用的瓶頸。而商業購買高效特異的鋅指核酸酶又價格昂貴（20萬人民幣/基因），一般研究者或商業公司根本無法承受這筆費用。

2009年兩個研究組發現植物病原體Xanthomonas中的一種可以調節植物基因表達的轉錄激活子樣效應因子（transcription?activator-like?effector，TALE）表現出DNA結合特異性，而其識別密碼具有模塊化和簡單化的特點，為科學家們開發出更簡易的新型基因組靶向修飾技術帶來了新希望。

TALE與Fok1融合后即形成轉錄激活子樣效應因子核酸酶（transcription?activator-like?effector?nucleases，TALEN）。TALEN的打靶原理與ZFN相同，只是識別特異DNA的蛋白不同。TALEs由數十個特異性識別DNA的串聯“蛋白模塊”和兩側的N-末端及C-末端序列組成。每個“蛋白模塊”包含34個氨基酸，第12和13位殘基是靶向識別的關鍵位點，被稱作重復可變的di-residues（RVDs）位點。然而不同于每個鋅指蛋白識別特異性的三聯體堿基，TALEs上的每個RVDs僅能識別一個堿基。

Sangamo?BioSciences公司和哈佛大學的兩個研究小組分別利用TALEs技術進行了基因組靶向修飾相關研究，兩篇研究論文發表在同一期的《自然生物技術》（Nature?Biotechnology）雜志上。

Edward?Rebar領導的研究小組將帶有不同C-末端TALE的截短片段連接到核酸酶FokI的催化結構域上。當研究人員將構建的TALENs靶向內源性的人類NTF3和CCR5基因時，證實TALENs能夠特異性地對這些基因片段進行剪切。哈佛大學研究小組開發了一種基于分層連接的策略來構建包含12個重復模塊的TALEs。他們在保留RVDs的基礎上減少了每個模塊的DNA序列，同時將剩余序列的重復性降到最低。進而通過12重PCR獲得了帶有特異性連接序列的單體，并將其克隆至包含TALE?N-末端和C-末端序列的骨架載體中。為了構建TALE轉錄因子，研究人員又將TALE融合到一個轉錄因子的激活域。在接下來的靶向性檢測中，研究人員證實其能特異地使四個檢測內源基因中的兩個基因表達上調。