[發明專利]光敏感基團保護的功能基團亞磷酰胺及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210163013.1
• 申請日: 2012-05-23
• 公開（公告）號: CN102898464A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 湯新景;蘇蒙
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C07F9/24
• 分類號: C07F9/24;C07F9/655;C07C271/16;C07C269/00;C07C205/42;C07C201/12;C07C329/06;C07D317/20;C12N15/113;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 余光軍

技術領域

本發明涉及亞磷酰胺化合物，尤其涉及光敏感基團保護的功能基團的亞磷酰胺化合物及其制備方法，本發明還涉及該亞磷酰胺化合物在寡聚核苷酸固相合成及5′端功能化中的應用，屬于寡聚核苷酸的固相合成及功能化領域。

背景技術

光活性基團指在光子激發下，能夠通過形成自由基或異裂中間體，發生化學變化的分子結構。它使在復雜體系中，尤其是在生理環境下，利用光控制小分子或生物大分子的變化成為可能。普遍認為，與溫度、酸堿度等其它的調控手段相比，光調控具有定位準確，調控及時，對體系影響小等諸多優點。通常所指的光活性基團可分為兩類，即：光異構化基團和光可切除基團。前者的光化學過程是可逆的，后者則是不可逆的化學過程。光可切除基團（caged/caging?moieties）的概念最早由J.F.Hoffman于1978年提出1，這類基團對340-370nm范圍內的光敏感，能夠有效地吸收這種能量的光子。最常見的光可切除基團是鄰硝基苯基及其衍生物，此外還有對羥基苯乙酰氧基、香豆素類、呫噸酮乙酸類化合物等。由于鄰位硝基的存在，在光激發后，鄰硝基苯乙醇類化合物形成五元環狀中間體，進而得到鄰亞硝基苯乙酮類化合物，與化合物中的其它部分斷開。由于鄰硝基苯乙醇及其衍生物的結構相比其它光可切除基團在合成中或生理環境下較為穩定，因此在大多數生物體系中被廣泛采用，如ATP，DNA，RNA，蛋白質，適配體等。

寡聚核苷酸可以用來做PCR引物，用于核酸序列檢測的探針、等位基因特異的寡聚核苷酸分析（Allele-specificoligonucleotide，ASO）、單堿基多樣性分析（Single?nucleotide?polymorphism，SNP）、反義寡聚核苷酸，其在分子生物學領域有廣泛的應用。

近幾十年來，寡聚核苷酸在分子生物學中發揮著越來越重要的作用，逐漸成為一種非常有效的研究工具。特別是近年來，相關的研究多集中在如何利用寡聚核苷酸從基因水平上研究各種疾病的產生機理及其相關基因的表達網絡，并使其通過調節基因的表達量來預防、診斷和治療相關疾病，作為藥物研發的另一種思路。

寡聚核苷酸功能化的傳統方法和應用：一般地，5′端的功能化是在寡聚核苷酸合成后加入含磷試劑的小分子帶保護基的官能團，脫保護后再經由這些官能團連接其它功能分子。如5′氨基有對甲氧基三苯基（MMTr）保護和三氟乙酰（TFA）保護的模塊，選用何種保護基由寡聚核苷酸的后處理決定。連接臂一般為6個碳，12個碳的連接臂用于某些特定情形，如在近距離會發生熒光淬滅的分子內。5′巰基有三苯基（Tr）保護基和二硫鍵保護兩種模塊，與MMTr不同，Tr對酸穩定，需小心地用硝酸銀將其脫去，過量的硝酸銀用TCEP沉淀后離心除去，而此步中過量的TCEP需經脫鹽除掉。為保證硫醚鍵或二硫醚鍵不被氧化，合成循環中最后一步需用0.2M的碘液。而二硫鍵保護的模塊可用TCEP斷開，脫鹽后直接使用。末端為巰基的ODN可繼續與熒光素、生物素或金屬納米粒結合，用于DNA芯片分析，熒光探針等分子生物學檢測。

在一段末端為氨基的寡聚核苷酸中連入含二硫醚的戊酸NHS活化物后能與金、銀納米粒表面結合，形成兩個硫-金鍵，結合的效率可達91%，而單一巰基則僅48%。這種強的DNA-金表面結合模式為DNA控制的納米粒自組裝提供了另一種可行的策略。最初引入5′端磷酸基時需使用含有砜的磷試劑，但如果合成最后DMTr在ODN上，則氨水在會將該保護基脫下暴露磷酸基，這樣會給反相HPLC的純化造成困難。

將鄰硝基芐醇結構保護的氨基和羧基與胸腺嘧啶單體的堿基連接，寡聚核苷酸合成后并光照處理后，即可暴露氨基和羧基。在鏈中加入功能分子還可通過修飾的DNA單體實現，即先將光活性基團連入胸腺嘧啶2′位置進行DNA合成，光脫保護后再連入功能分子。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種能夠應用于寡聚核苷酸的固相合成及功能化的光敏感基團保護的功能基團的亞磷酰胺化合物；

本發明的目的之二是提供一種合成所述亞磷酰胺化合物的方法；

本發明的目的之三是將所述的亞磷酰胺化合物應用于寡聚核苷酸的固相合成及功能化。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

應用于寡聚核苷酸固相合成及功能化的光敏感基團保護的功能基團的亞磷酰胺化合物，為式Ⅰ或式Ⅱ所示結構的化合物：