[發明專利]光敏感的功能化固載相及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210162973.6
• 申請日: 2012-05-23
• 公開（公告）號: CN102702010A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 湯新景;蘇蒙
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C07C233/20
• 分類號: C07C233/20;C07C233/38;C07C231/12;C07C235/10;C07C271/12;C07C275/20;C07C275/64;C07C329/06;C07C333/04;C07D249/04;C07H21/00;C07H1/00;C12Q1/
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 余光軍

技術領域

本發明涉及寡聚核苷酸的功能化固載相，尤其涉及光敏感的功能化化合物以及用該化合物制備的光敏感的功能化固載相及其制備方法，本發明還涉及所述光敏感的功能化固載相在寡聚核苷酸固相合成和功能化中的應用，屬于寡聚核苷酸的固相合成和功能化領域。

背景技術

光活性基團指在光子激發下，能夠通過形成自由基或異裂中間體，發生化學變化的分子結構。它使在復雜體系中，尤其是在生理環境下，利用光控制小分子或生物大分子的變化成為可能。普遍認為，與溫度、酸堿度等其它的調控手段相比，光調控具有定位準確，調控及時，對體系影響小等諸多優點。通常所指的光活性基團可分為兩類，即：光異構化基團和光可切除基團。前者的光化學過程是可逆的，后者則是不可逆的化學過程。光可切除基團（caged/caging?moieties）的概念最早由J.F.Hoffman于1978年提出¹，這類基團對340-370nm范圍內的光敏感，能夠有效地吸收這種能量的光子。最常見的光可切除基團是鄰硝基苯基及其衍生物，此外還有對羥基苯乙酰氧基、香豆素類、呫噸酮乙酸類化合物等。由于鄰位硝基的存在，在光激發后，鄰硝基苯乙醇類化合物形成五元環狀中間體，進而得到鄰亞硝基苯乙酮類化合物，與化合物中的其它部分斷開。由于鄰硝基苯乙醇及其衍生物的結構相比其它光可切除基團在合成中或生理環境下較為穩定，因此在大多數生物體系中被廣泛采用，如ATP，DNA，RNA，蛋白質，適配體等。

寡聚核苷酸可以用來做PCR引物，用于核酸序列檢測的探針、等位基因特異的寡聚核苷酸分析（Allele-specific?oligonucleotide，ASO）、單堿基多樣性分析（Single?nucleotide?polymorphism，SNP）、反義寡聚核苷酸，其在分子生物學領域有廣泛的應用。

近幾十年來，寡聚核苷酸在分子生物學中發揮著越來越重要的作用，逐漸成為一種非常有效的研究工具。特別是近年來，相關的研究多集中在如何利用寡聚核苷酸從基因水平上研究各種疾病的產生機理及其相關基因的表達網絡，并使其通過調節基因的表達量來預防、診斷和治療相關疾病，作為藥物研發的另一種思路。

當寡聚物需要雙標記或需要對3′內切酶穩定時，便需在3′端進行修飾。對于引入3′氨基的固相，其優點是Fmoc能在固相上選擇性地脫除，從而繼續在固相進行ODN的功能化綴合。同時，這種固相引入了一個手性碳原子，在HPLC純化時可能會發現其一對光學異構的寡聚物。其不足是，盡管在寡聚物合成過程中較為穩定，但如果處理失當，某些Fmoc保護基會脫去，這樣自由的氨基會與合成循環中封閉一步所用的醋酸酐發生反應，預期寡聚物的產率降低。另一種引入氨基的固相是利用鄰苯二甲酰亞胺分子，使用濃氨水即可將寡聚物從固相上切下暴露氨基。這種連接臂對合成循環穩定且不存在手性中心。此外還有在固相上第一個堿基為具氨基側鏈的胞嘧啶或胸腺嘧啶的氨基化方法。

對于3′巰基的修飾有二硫鍵保護的巰基修飾的CPG，在合成中為保證二硫鍵不被氧化，所有氧化步驟需使用0.2M的碘液，合成后用濃氨水從固相上切下（55℃，4小時），HPLC純化后用TCEP水溶液斷開二硫鍵，不需經HPLC純化即可使用。Shankar研究組曾報告經其修飾的固相先經高氯酸汞處理，然后在THF和甲醇的混合體系中350nm光照2小時可以高于70%的收率釋放固相上連接的Fmoc-氨基丙酸和膽固醇等小分子。而將固相直接暴露在日光下，7天僅釋放5%。此方法可降低固相對日光的敏感度，便于操作。Greenberg等人報告稱3′端為磷酸基的ODN不會被濃氨水從固相上切下，而固相上脫保護的ODN可作為雜交探針，光照后雜交后的雙螺旋寡聚物即從固相切下，有錯配堿基的反義鏈側不能結合在固相上。

3′羥基的固相用Pd⁰在pH為5.5的環境下脫除堿基和五價磷的保護基，然后用光從固相切割下。這種方法可以在ODN中引入對濃氨水敏感或不能經合成轉化而得到的非天然5-羥基胞嘧啶。用3′氨基固相合成ODN，而后光解，在液相中3′端連入芘、甾體、生物素、三肽等小分子，再脫去堿基保護基和5′-DMTr。或在固相合成后，脫DMTr保護基，5′端連入功能分子，在液相中光解后在3′端連入其它分子，最后濃氨水脫堿基保護基和乙腈氧基³⁹。這在很大程度上豐富了寡聚核苷酸綴合物的合成方法。3′羧基的功能化也有報道。