[發明專利]枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因序列及其應用

無效

• 申請號: 201210161684.4
• 申請日: 2012-05-22
• 公開（公告）號: CN102732542A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 劉永鋒;于俊杰;陳志誼;聶亞鋒
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N15/70;A01P3/00
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 程化銘

1.一種枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因序列，其特征在于：所述基因序列如SEQ?ID?NO:1所示。

2.一種枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶氨基酸序列，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

3.一種枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因序列的表達，其特征在于包括如下步驟：

(1)、構建含枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因的質粒PET28a-Baci：利用引物對擴增枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因，在5’端加上GGATCC以構成BamH?I識別位點，3’端加上CTCGAG以構成Xho?I識別位點，將該開放閱讀框片段克隆至大腸桿菌表達載體PET-28a(+)相應的酶切位點中構成質粒PET28a-Baci；

所用引物對為：BaciF:?aaaGGATCCATGTCAAAAGAAAATAACTGCAATATCC；

BaciR:?aaaCTCGAGTCAGCATTTCTTTTTGACGACAGGGTGT；

(2)、將PET28a-Baci轉化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中進行誘導表達：將PET28a-Baci轉化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，將含有PET28a-Baci的BL21(DE3)?pLysS菌株于LB液體培養基中，120rpm，搖培12小時，取培養菌液以1:100的比例接種于2×YTA液體培養基中，37oC，200r/min培養至OD₆₀₀為0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，30oC誘導表達4h，離心收集菌體；

(3)、蛋白純化：將步驟(2)中表達的菌體按10％培養液體積懸浮于含0.5mol/L?NaC1的20mmol/L，pH7.0的磷酸鈉緩沖液中，超聲波破碎，14000r/min離心10min，上清液用HisTrap?FF柱參照使用說明作進一步純化，得到純化蛋白液，其中平衡和洗脫用緩沖液分別為含20mmol/L和400mmol/L咪唑的上述菌體破碎緩沖液。

4.根據權利要求3所述的枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因序列的表達，其特征在于：步驟(2)中所述LB液體培養基為：胰蛋白胨10g·L^-1、酵母提取物5?g·L^-1、氯化鈉5?g·L^-1。

5.根據權利要求3所述的枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因序列的表達，其特征在于：步驟(2)中所述2×YTA液體培養基為：蛋白胨16?g·L^-1、酵母提取物.10?g·L^-1、NaCl?5?g·L^-1。

6.一種枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶在防治植物病害中的應用。

7.根據權利要求6所述的枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶在防治植物病害中的應用，其特征在于：在農業上作為蛋白質農藥或抗病基因資源。