[發明專利]枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因序列及其應用

無效

• 申請號: 201210161684.4
• 申請日: 2012-05-22
• 公開（公告）號: CN102732542A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 劉永鋒;于俊杰;陳志誼;聶亞鋒
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N15/70;A01P3/00
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 程化銘

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因序列及其應用。

背景技術

枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）是一類好氧、產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，是分布在土壤、植物表面和根際的重要微生物種類，能產生一系列代謝產物抑制其它微生物的生長，具有防治植物病害的作用。目前在全世界保存的野生型枯草芽孢桿菌菌株有幾百種，研究證實枯草芽孢桿菌能夠產生40多種具有不同結構和功能的抗菌物質。枯草芽孢桿菌能產生多種對植物病原真菌具有抑制活性的物質，主要為低分子量的多肽類抗生素和一些高分子量的蛋白類抗菌物質。申請者實驗室前期從枯草芽孢桿菌Bs-916中分離到分子量約為45KDa的抑菌活性蛋白Bacisubin（ZL200610097847.1），該蛋白對核盤菌（Sclerotinia?sclerotiorum）和立枯絲核菌（Rhizoctonia?solani）等病菌生長具有明顯的抑制作用。利用Q-TOF質譜檢測到Bacisubin多個肽段，初步鑒定其為草酸脫羧酶。

草酸是多種植物病原真菌重要的致病因子，如核盤菌（Sclerotinia?sclerotiorum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia?Solani）和Septoria?musiva等，在這些病原真菌與寄主相互作用過程中，草酸的分泌為它們的生長、繁殖提供了有利條件，通過調節pH環境調控致病相關基因的表達，增強致病相關酶的活性，并可抑制植物抗病相關的氧化反應。草酸脫羧酶（Oxalate?decarboxylase，OXDC）可催化草酸分解產生甲酸和二氧化碳，該催化反應通常需要Mn²⁺或Mg²⁺作為輔助因子，并需要O₂的參與，該酶與草酸氧化酶同屬于cupin蛋白家族，在結構和功能上存在相似之處。草酸脫羧酶最初被發現存在于白腐菌（Pleurotus?ostreatus）中，隨后發現其存在于多種真菌中，在豚鼠的肝臟中在也發現該酶的存在。枯草芽孢桿菌（Baciilus?subtilis）標準菌株BS-168在低pH條件下也可誘導產生草酸脫羧酶，且對由核盤菌的引起的油菜菌核病具有明顯的抑制作用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌草酸鹽脫羧酶基因序列及其應用。

本發明的目的是通過下列技術措施實現的：一種枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因序列，所述基因序列如SEQ?ID?NO:1所示。

一種枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

一種枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因序列的表達，包括如下步驟：

1)、構建含枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因的質粒PET28a-Baci：利用引物對擴增枯草芽孢桿菌Bs-916草酸鹽脫羧酶基因，在5’端加上GGATCC以構成BamH?I識別位點，3’端加上CTCGAG以構成Xho?I識別位點，將該開放閱讀框片段克隆至大腸桿菌表達載體PET-28a(+)相應的酶切位點中構成質粒PET28a-Baci；

所用引物對為：BaciF:aaaGGATCCATGTCAAAAGAAAATAACTGCAATATCC；

??????????????BaciR:aaaCTCGAGTCAGCATTTCTTTTTGACGACAGGGTGT；

2)、將PET28a-Baci轉化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中進行誘導表達：將PET28a-Baci轉化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，將含有PET28a-Baci的BL21(DE3)pLysS菌株于LB液體培養基中，取培養菌液以1∶100的比例接種于2×YTA液體培養基中，37°C，200r/min培養至OD₆₀₀為0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，30°C誘導表達4h，離心收集菌體；

3)、蛋白純化：將步驟(2)中表達的菌體按10％培養液體積懸浮于含0.5mol/L?NaC1的20mmol/L，pH7.0的磷酸鈉緩沖液中，超聲波破碎，14000r/min離心10min，上清液用HisTrapFF柱參照使用說明作進一步純化，得到純化蛋白液，其中平衡和洗脫用緩沖液分別為含20mmol/L和400mmol/L咪唑的上述菌體破碎緩沖液。