[發明專利]從臍帶中分離和擴增間充質干細胞的方法

無效

• 申請號: 201210160405.2
• 申請日: 2012-05-22
• 公開（公告）號: CN102660503A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 周丹;林卓衡;朱業峰;陳俊峯
• 申請（專利權）人: 博雅干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及從臍帶新鮮組織中分離和擴增干細胞的方法，特別涉及從臍帶新鮮組織中分離和擴增間充質干細胞的方法。

背景技術

研究發現骨髓中蘊含豐富的間充質干細胞(mesenchymal?stem?cell，MSC)，由于這類細胞具有多向分化潛能、免疫調控和自我復制等特點，所以漸漸受到人們的關注。間充質干細胞能誘導分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞。連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，對治療衰老和組織器官損傷修復有很大的臨床應用價值。

但隨著年齡的老化，骨髓中的干細胞數目也顯著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退；移植給異體可能引起免疫反應；提取干細胞過程對患者的損傷性和在采集時遇到的其他問題，都直接影響了骨髓間充質干細胞的臨床應用，使得尋找骨髓以外其他可替代的間充質干細胞來源成為一個重要的問題。

近期的研究顯示，臍帶組織中也含有間充質干細胞并且能成功分離。這種組織來源的間充質干細胞不僅保持了間充質干細胞的生物學特性，而且分離出來的干細胞更原始，有更強的增殖分化能力。其免疫細胞的功能活性低，大大減低了觸發免疫反應及引起移植物抗宿主病的風險。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過程簡單，對產婦及新生兒無任何危害及損傷。以上原因足以令臍帶間充質干細胞成為骨髓間充質干細胞的理想替代物。

因此，本領域需要有從臍帶中分離和擴增間充質干細胞的簡單、有效的方法，以滿足臨床需求。

發明內容

本發明的目的是解決現有獲取臍帶間充質干細胞方法的缺陷，提供一種實用簡單的從體外臍帶中分離和擴增間充質干細胞的方法。本發明發現使用一種組織貼壁法可以有效地從臍帶組織分離原代間充質干細并進行培養。本發明基于此發現而得以完成。

因此，本發明第一方面提供了從臍帶新鮮組織中分離和擴增間充質干細胞的方法，該方法包括以下步驟：

(1)消毒和清洗：用酒精將臍帶組織表面消毒；將臍帶從中間剪開，平鋪在平皿上；利用PBS清洗組織，以減少組織上的紅細胞；

(2)臍帶組織貼壁處理：將組織剪成塊狀，再平鋪于另一細胞培養平皿中，每個平皿中的組織塊數量維持在5-20塊(例如10-15塊)；使組織塊風干2-50分鐘（例如5-25分鐘，例如10-15分鐘）直至組織貼在平皿上；

(3)臍帶組織培養：沿平皿邊緣慢慢加入間充質干細胞專用培養基至組織淹沒即可；將平皿放進CO₂濃度為5%的37℃培養箱進行培養，培養至第3-7天(例如第4-6天，例如第5天)時將平皿從培養箱取出，補加適量(使組織淹沒即可)間充質干細胞專用培養基；在第9-11天(例如第10天)時將平皿中的培養基移出，加入適量(使組織淹沒即可)新鮮的間充質干細胞專用培養基，繼續培養；在第11-13天(例如第12天)時清除所有臍帶組織塊并繼續培養；此后每1-3天(例如每2天)進行一次全換液；

(4)細胞傳代：當平皿內的貼壁細胞融合率達到50-70%左右時，使用消化酶(例如TrypLE?Express，invitrogen產品)使貼壁細胞脫離平皿底部；離心，去除上清液，加入間充質干細胞專用培養基重新懸浮細胞，再接種于T25細胞培養瓶進行傳代并進行擴增培養；此后每1-3天(例如每2天)換液一次，直至融合率達到70-90%后，即得臍帶間充質干細胞，必要時進行傳代；

以及任選的下列一個或多個步驟：

(5)針對步驟(4)所得臍帶間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項：細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；

(6)將步驟(4)所得傳代后的臍帶間充質干細胞于液氮中凍存，備用。

根據本發明第一方面的方法，其中所述臍帶是臍帶的新鮮組織。

根據本發明第一方面的方法，其中所述臍帶組織處理在生物安全柜內進行。

根據本發明第一方面的方法，其中所述培養平皿是直徑5-20cm的培養平皿，優選是直徑約10cm的培養平皿。

根據本發明第一方面的方法，其中所述PBS是磷酸的鈉鹽和/或鉀鹽配制的，其pH為5.0-8.0(優選pH為5.5-7.6，優選pH為6.0-7.0)。在一個實施方案中，所述PBS中磷酸根的濃度為0.01-0.5M，優選0.02-0.1M。在本發明下文試驗中，所用PBS是磷酸鈉鹽，其中磷酸根的濃度為0.025M，pH為6.5。需要說明的是，本發明人發現，在上述范圍內的PBS濃度和pH值對于本發明方法的效果影響不大。